Beurteilung der elektrischen Penetration von Zellmembranen anhand von vier

Microsystems & Nanoengineering Band 8, Artikelnummer: 68 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die elektrische Durchdringung der Zellmembran ist entscheidend für die Bestimmung des Zellinneren mittels Impedanzzytometrie. Hier schlagen wir eine Methode zur Bestimmung der Leitfähigkeit der Zellmembran durch die Neigungsniveaus von Impedanzimpulsen vor. Bei der elektrischen Penetration fließt ein hochfrequenter Strom ungehindert durch die Zellmembran; Somit kann die intrazelluläre Verteilung direkt auf die hochfrequenten Impedanzimpulse einwirken. Numerische Simulationen zeigen, dass eine ungleichmäßige intrazelluläre Komponentenverteilung die Neigungsgrade von Impedanzimpulsen beeinflussen kann und dass die Neigungsgrade zuzunehmen beginnen, wenn die Zellmembran elektrisch durchdrungen wird. Experimentelle Beweise zeigen, dass höhere Erkennungsfrequenzen (>7 MHz) zu einer breiteren Verteilung der Neigungsniveaus von Impedanzimpulsen führen, wenn Zellpopulationen mit Vierfrequenz-Impedanzzytometrie gemessen werden. Dieser Befund ermöglicht uns die Feststellung, dass eine Detektionsfrequenz von 7 MHz in der Lage ist, die Membran von Euglena gracilis (E. gracilis)-Zellen zu passieren. Darüber hinaus bieten wir eine mögliche Anwendung der Vierfrequenz-Impedanzzytometrie bei der Biomasseüberwachung einzelner E. gracilis-Zellen. Zur Überwachung dieser Biomasseveränderungen kann eine Hochfrequenzimpedanz (≥7 MHz) und zur Verfolgung der entsprechenden Biovolumenveränderungen eine Niederfrequenzimpedanz (<7 MHz) eingesetzt werden. Insgesamt demonstriert diese Arbeit eine einfache Bestimmungsmethode für die elektrische Penetration der Zellmembran, und die vorgeschlagene Plattform ist für die Multiparameter-Bewertung des Zellzustands während der Kultivierung anwendbar.

Die Biomassebewertung einzelner Zellen spielt in vielen Bereichen eine entscheidende Rolle, einschließlich der Analyse des Zellzustands1 und des Zellwachstumsmechanismus2 sowie von Umwelt- und Energiefragen3,4. Bisher wurden mehrere Techniken, darunter Live-Cell-Imaging5, Raman-Durchflusszytometrie6 und chemische Sonden7, erfolgreich für die Hochdurchsatzbewertung der intrazellulären Biomasse in einzelnen Zellen eingesetzt. Die meisten dieser optisch basierten Ansätze sind jedoch zeit- und arbeitsintensiv, und die hohen Anforderungen an die Wartung und Kalibrierung von Strahlfokussierungspunkten schränken ihre Robustheit und Tragbarkeit ein. In dieser Arbeit haben wir eine effektivere und bequemere Methode zur Charakterisierung von Biomasse anhand der Größen hochfrequenter Impedanzsignale vorgeschlagen.

Als Alternative hat sich die Impedanzzytometrie als anwendbar für die markierungsfreie und kostengünstige Einzelzellcharakterisierung erwiesen8. Bisher wurde die Impedanzzytometrie erfolgreich zur Analyse der Morphologie9, Steifheit10 und Zustände11 einzelner Zellen eingesetzt. Es hat sich gezeigt, dass die Größe und Morphologie von Impedanzimpulsen vom Volumen12 bzw. der Form13 einzelner Zellen abhängt. Darüber hinaus hat die Forschung herausgefunden, dass die Hochfrequenz-Impedanzerkennung zur Charakterisierung von Membraneigenschaften geeignet ist14,15. Beispielsweise steigt die Leitfähigkeit der Zellmembran mit zunehmender Detektionsfrequenz über 1 MHz14, und die Membranleitfähigkeit hängt mit der Lebensfähigkeit der Zelle zusammen. Sui et al.16 und Zhong et al.17 haben gezeigt, dass eine Erkennungsfrequenz von 5–8 MHz ausreicht, um Strom durch die Membranen lebender Zellen von Säugetieren fließen zu lassen. Diese Schlussfolgerung wird aus den Unterschieden in der Membranleitfähigkeit zwischen inaktivierten und lebenden Zellen gezogen. Ohne Vergleich mit inaktivierten Zellen gibt es nur wenige Berichte über anwendbare Methoden zur direkten Bestimmung, ob die Membran leitfähig ist.

Bei der Messung intrazellulärer Biomasse mittels Impedanzzytometrie ist es notwendig, die Nachweisfrequenz zu bestimmen, die die Zellmembran durchdringen kann. Unsere Lösung besteht darin, den Neigungsgrad von Impedanzimpulsen als Neigungsindex13 zu quantifizieren und dann die Leitfähigkeit der Zellmembran anhand des Neigungsindex der Zellpopulation bei verschiedenen Erkennungsfrequenzen zu beurteilen. Basierend auf unserer früheren Arbeit wurde festgestellt, dass die Verteilung der intrazellulären Komponenten den Neigungsgrad hochfrequenter Impedanzimpulse (6 MHz) beeinflusst18,19, da sich ein Hochfrequenzstrom innerhalb einzelner Zellen zwischen nichtleitenden intrazellulären Komponenten ausbreiten kann. Im Gegensatz dazu kann ein niederfrequenter Strom (500 kHz) die Zellmembran nicht durchdringen und breitet sich hauptsächlich um die Zelle aus18,19. Diese Funktion ermöglicht eine neuartige Methode zur Bestimmung der Erkennungsfrequenz des Zellinneren und -äußeren basierend auf dem Neigungsindex von Impedanzimpulsen. Zellinnenräume sind heterogener als ihre Morphologien in einer Population. Wenn die Erkennungsfrequenz hoch genug ist, um die Zellmembran zu durchdringen, variiert der Neigungsindex der Impedanzimpulse für eine Zellpopulation stärker. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass der Neigungsgrad von Impedanzimpulsen zur Bestimmung der Erkennungsfrequenz des Zellinneren verwendet wurde.

In dieser Arbeit wurde die Vierfrequenz-Impedanzzytometrie eingesetzt, um die Leitfähigkeit einzelner Euglena gracilis-Zellen (E. gracilis) zu analysieren, wie in Abb. 1a dargestellt. Zunächst wurde die Impedanzerkennung bei verschiedenen Frequenzen einzelner E. gracilis-Zellen verwendet, um zu bestimmen, bei welcher Erkennungsfrequenz der Strom durch die Zellmembran fließen kann. Wenn ein hochfrequentes elektrisches Feld die Zellmembran durchdringt, kippt die ungleichmäßige intrazelluläre Verteilung die Impedanzimpulse nach links oder rechts (siehe Abb. 1b), ein Phänomen, das in Simulationen und Experimenten bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde die vorgeschlagene Vierfrequenz-Impedanzzytometrietechnik (d. h. 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz und 10 MHz) angewendet, um die Biomasse einzelner E. gracilis-Zellen aus viertägigen Kulturen unter verschiedenen Bedingungen basierend auf der Fähigkeit zu überwachen der Hochfrequenzimpedanz zum Nachweis intrazellulärer Biomasse. Das elektrische Scannen von E. gracilis-Zellen im Inneren und Äußeren zeigte deutlich zelluläre Reaktionen auf verschiedene Kultivierungsmedien mit organischen Quellen oder anorganischen Ionen, wobei die Zellen signifikante Unterschiede in der Vermehrung, im Volumen und in der Opazität aufwiesen. Das Volumen einzelner Zellen wurde über niederfrequente Impedanzgrößen überwacht und ihre Biomasseänderungen wurden über hochfrequente Impedanzgrößen verfolgt. Das Impedanzerkennungssystem wurde auf einer FPGA-Platine (Field Programmable Gate Array) (siehe Abb. 1c) mit einem selbstgebauten Transimpedanzverstärker (siehe Abb. 1d)20 aufgebaut. Wir gehen davon aus, dass der Neigungsindex eine alternative Methode zur Bestimmung der Häufigkeit der elektrischen Durchdringung von Zellmembranen ermöglichen kann. Darüber hinaus kann die vorgeschlagene impedanzbasierte Plattform zur Bewertung von Zellzuständen und Biomasse eingesetzt werden, was für praktische Anwendungen mit kontinuierlichen Zellkulturen von entscheidender Bedeutung ist21,22.

a Mikrofluidische Impedanzzytometrie zum Nachweis von E. gracilis-Zellen und einigen wichtigen Strukturen einzelner E. gracilis-Zellen. b Impedanzsignale bei vier verschiedenen Frequenzen (dh 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz und 10 MHz) und die Auswirkung der intrazellulären Komponentenverteilung auf die Morphologie hochfrequenter Impedanzsignale. c Impedanzanalysator und (d) Frequenzgang des selbst entwickelten Transimpedanzverstärkers

Um die Penetrationsfrequenz einzelner Zellen zu bestimmen, führten wir eine numerische 2D-Simulation über das AC/DC-Modul der COMSOL 5.6 Multiphysics-Software (COMSOL Inc., Burlington, MA, USA) durch. Hierin wurden E. gracilis-Zellen als einschalige Ellipsen simuliert (Radius: 30 μm lange Achse, 10 μm kurze Achse) und die Zellmembran (10 nm) wurde mithilfe der Kontaktimpedanznäherung modelliert23. Intrazelluläre Komponenten wurden als 2D-Kreise vereinfacht (Membrandicke 20 nm und Durchmesser 1 μm) und eng im linken Inneren der Zelle platziert 18, 19, wie in Abb. 2a gezeigt. Weitere Parameter der in der Simulation verwendeten Zellen18 sind in Tabelle S1 in den Zusatzinformationen aufgeführt.

a Verteilung des elektrischen Potenzials bei sechs verschiedenen Frequenzen, darunter 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 20 MHz und 100 MHz. Die Dichte der schwarzen Stromlinien gibt die Stromdichte (A m−2) an. b Simulierte Impedanzimpulse bei den vier in dieser Arbeit verwendeten Erkennungsfrequenzen. c–e Drei simulierte Spektren von Frequenzen vs. (c) Neigungsindex, (d) normalisierter Breite und (e) normalisierter Impedanz der Impedanzimpulse. Beachten Sie, dass die Impedanzgröße und die Breite der Impedanzimpulse basierend auf den niederfrequenten Impedanzmetriken normalisiert wurden

Bei der Impedanzerkennung ist die Leitfähigkeit der Zellmembran frequenzabhängig, und wie in Abb. 2a dargestellt, nimmt die Stromdichte im Inneren der Zelle mit zunehmender Erkennungsfrequenz allmählich zu. Der nahtlose Durchgang von Hochfrequenzstrom durch die Zellmembran zeigt die Anwendbarkeit der Hochfrequenzimpedanzerkennung zur Charakterisierung intrazellulärer Komponenten. In der Simulation deutet die zunehmende Stromdichte innerhalb der Zelle darauf hin, dass der Hochfrequenzstrom mit zunehmender Detektionsfrequenz immer besser durch die Zellmembran fließen kann.

Abbildung 2b zeigt die Impedanzimpulse, die dasselbe Zellmodell bei vier Erkennungsfrequenzen induziert haben. Mit zunehmender Erkennungsfrequenz nimmt der Widerstand des Zellmodells gegen die Stromausbreitung ab, was zu kleineren Größen der Impedanzimpulse führt. Darüber hinaus sind die Impedanzimpulse, die Zellen mit symmetrischen Formen bei einer niedrigen Erkennungsfrequenz (500 kHz) entsprechen, symmetrisch. Im Gegensatz dazu ist das rechtshohle Zellinnere für die Induktion asymmetrischer Impedanzimpulse bei hohen Detektionsfrequenzen verantwortlich. Die rechte Hälfte der Impedanzimpulse dauert länger als die linke Hälfte. Dieses Phänomen kann durch den Tilt-Index quantifiziert werden, der als Verhältnis der Zeitspannen auf beiden Seiten des Impedanzimpulses minus eins definiert ist (siehe Abb. 2b). Konkret beträgt der Neigungsindex 0,009 für symmetrische Impedanzimpulse bei 500 kHz, während er für asymmetrische Impedanzimpulse bei 10 MHz –0,201 beträgt. Genauere Informationen zum Neigungsindex finden Sie in Abb. S1 in den Zusatzinformationen.

Abbildung 2c zeigt die Abhängigkeit des Neigungsindex von der Erkennungsfrequenz von 100 kHz bis 100 MHz. Alle Neigungsindizes werden mit dem Wert (Null) bei einer niedrigen Erkennungsfrequenz von 100 kHz verglichen. Ein zunehmender Neigungsindex zeigt den zunehmenden Einfluss der intrazellulären Komponentenverteilung auf den Neigungsgrad der Impedanzimpulse an. Mit zunehmender Erkennungsfrequenz neigt die innere Struktur der rechten Seite der gesamten Zelle die Impedanzimpulse allmählich nach rechts. Bei etwa 10 MHz erreicht der Tilt-Index einen Extremwert und danach beginnt die elektrische Durchdringung der intrazellulären Komponenten (siehe Abb. 2a). Im Vergleich dazu enthalten die Breite und Größe von Impedanzimpulsen (siehe Abb. 2d, e) nur wenige Informationen über die intrazelluläre Komponentenverteilung. Beide Werte nehmen mit zunehmender Nachweishäufigkeit aufgrund des abnehmenden Widerstands der Zellmembran ab, wie bereits in verschiedenen Studien nachgewiesen wurde8,24.

Zellinnenräume sind heterogener als ihre Morphologien in einer Population. Heterogene innere Strukturen führen dazu, dass der Neigungsindex zunehmend dezentralisiert wird, wenn das elektrische Feld beginnt, die Zellmembran zu durchdringen. Die Simulationsergebnisse der Frequenzabhängigkeit des Neigungsindex, gemessen mit vier verschiedenen Modellen, darunter 10-μm-Kügelchen, Hohlzellen, linkshohlen Zellen und rechtshohlen Zellen, sind in Abb. 3a – c dargestellt. Bei Detektionsfrequenzen im Bereich von 100 kHz bis 100 MHz kann der Strom die nichtleitenden Perlen nicht durchdringen. Somit haben die Impedanzimpulse der Perlen immer eine symmetrische Form und die Neigungsindizes bleiben Null (siehe Abb. 3b). Im Gegensatz dazu ist die Form der Impedanzimpulse bei Hohlzellen asymmetrisch, sobald der Strom die Zellmembran durchdringt. Bei Erkennungsfrequenzen über etwa 100 kHz beginnt der Neigungsindex beispielsweise bei Null anzusteigen und erreicht einen Maximalwert bei etwa 10 MHz. Aufgrund dieses Phänomens ist es möglich, dass die Ausbreitung des Stroms innerhalb der Zelle die asymmetrische Form der Impedanzimpulse verursacht.

a Analyse der Verteilung des elektrischen Potenzials bei zwei verschiedenen Frequenzen, 500 kHz und 10 MHz, basierend auf vier Arten von Simulationsmodellen, darunter 10-μm-Kügelchen, Hohlzellen, linkshohle Zellen und rechtshohle Zellen. b Frequenzabhängigkeit des durch 10-μm-Kügelchen und Hohlzellen induzierten Neigungsindex. c Frequenzabhängigkeit des durch alle vier Arten von Simulationsmodellen induzierten Neigungsindex. d, e Violindiagramme der experimentellen Ergebnisse des Neigungsindex, der durch (d) 10 μm große Polystyrolkügelchen und (e) E. gracilis-Zellen bei 12 verschiedenen Erkennungsfrequenzen, einschließlich 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz, 500, induziert wird kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz und 16 MHz

Wenn sich außerdem Komponenten innerhalb der Zellmembran befinden, sind die Neigungsgrade der Impedanzimpulse deutlicher erkennbar, als wenn das Zellinnere hohl ist (siehe Abb. 3c). Daher kann der durch die Zellmembran verursachte Neigungsindex für normale Zellen in der praktischen Erkennung vernachlässigt werden, da sich innerhalb der Zellmembran immer intrazelluläre Komponenten wie Organellen oder Makromoleküle befinden. Darüber hinaus zeigt der Tilt-Index mit zunehmender Nachweishäufigkeit eine Abhängigkeit von der intrazellulären Komponentenverteilung. Mit Ausnahme des Vorzeichens gab es nahezu keinen Unterschied in den Werten des Neigungsindex, der durch das rechtshohle oder linkshohle Zellmodell induziert wurde. Der für ein linkshohles Zellmodell gemessene Neigungsindex ist immer dann positiv, wenn die Detektionsfrequenz ausreicht, um die Membran zu durchdringen, da die linkshohle Struktur dazu führt, dass die Impedanzimpulse nach links kippen. Bei rechtshohlen Zellen sind die Neigungsindizes immer negativ. Bevor intrazelluläre Komponenten durch hochfrequente elektrische Felder polarisiert werden, nimmt der Unterschied im Neigungsindex, der durch die Zellmodelle mit linker oder rechter Hohlzelle induziert wird, allmählich zu. Darüber hinaus deutet dieser auftretende Unterschied darauf hin, dass die Zellmembran elektrisch durchdrungen wird.

Abbildung 3d, e veranschaulichen die durch E. gracilis-Zellen bzw. 10-μm-Kügelchen induzierten Neigungsindizes. Mithilfe der Vierfrequenz-Impedanzzytometrie wurden einzelne Zellen oder Partikel bei 12 verschiedenen Erkennungsfrequenzen gemessen. Es wurden drei unabhängige Messungen durchgeführt, wobei wir den ersten Satz von Erkennungsfrequenzen innerhalb von 500 kHz (d. h. 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz) und den zweiten Satz zwischen 500 kHz und 10 MHz (d. h. 500 kHz, 4) angewendet haben MHz, 7 MHz und 10 MHz) und der dritte Satz über 10 MHz (11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz und 16 MHz). Bei nichtleitenden Polystyrolkügelchen schwankte ihr Neigungsindex in einem stabilen Bereich, wenn Frequenzen unter 13 MHz angelegt wurden. Danach führte eine höhere Erkennungsfrequenz zu einer dezentraleren Verteilung des Neigungsindex. Dies kann daran liegen, dass die Erkennungsfrequenz (>13 MHz) die Obergrenze unseres Impedanzerkennungssystems überschreitet. Für die E. gracilis-Zellen beginnt der Neigungsindex ab 7 MHz zu dezentralisieren; Somit erfolgt die elektrische Durchdringung der Zellmembran. Im Vergleich zum Neigungsindex von Polystyrolkügelchen kann bei Frequenzen unter 13 MHz ein Geräteeinfluss ausgeschlossen werden.

Durch den Vergleich von Abb. 3c und e können wir den Schluss ziehen, dass die zunehmende Dezentralisierung des Neigungsindex auf die elektrische Durchdringung der Zellmembran hinweist. In dieser Arbeit reicht eine Frequenz von 7 MHz aus, um die Zellmembran zum Nachweis intrazellulärer Komponenten zu durchdringen. Auch unsere bisherigen Erkenntnisse stützen diese Schlussfolgerung18,19.

Nach der Bestimmung der elektrischen Penetrationsfrequenz der Zellmembran verwendeten wir niederfrequente Impedanzmetriken (d. h. 500 kHz und 4 MHz), um die Volumenänderungen in E. gracilis-Zellen während der photomixotrophen Kultivierung zu verfolgen, sowie hochfrequente Impedanzmetriken ( d. h. 7 MHz und 10 MHz), um die Ansammlung von Biomasse zu überwachen. Wir haben E. gracilis-Zellen vier Tage lang in Koren-Hutner (KH)-Medium kultiviert, und Impedanzsignale wurden verwendet, um die Biomasseakkumulation von E. gracilis-Zellen zu bestimmen, die photomixotroph gezüchtet wurden. Die Impedanzerkennung von E. gracilis-Zellen ist in Film S1 und Abb. S2 in den Zusatzinformationen dargestellt. In dieser Arbeit wurde eine maximale Erkennungsfrequenz von 10 MHz verwendet, die in unserem System gut funktionierte und auch häufig für die Analyse des Zellinneren verwendet wird8. Die niedrigste Erkennungsfrequenz (500 kHz) wurde in unserer vorherigen Arbeit verwendet, um das Volumen und die Form einzelner Zellen zu charakterisieren . Die beiden mittleren Frequenzen 4 MHz und 7 MHz wurden im Abstand von 3 MHz ausgewählt.

E. gracilis-Zellen können sich bei photomixotropher Kultivierung schnell vermehren und Paramylon ansammeln, indem sie entweder Photosynthese betreiben oder organische Kohlenstoffquellen im Kultivierungsmedium (KH-Medium) verdauen. Die über vier Tage in KH-Medium kultivierten E. gracilis-Zellen sind in Abb. 4a) dargestellt. Wie in Abb. 4b gezeigt, stieg die Anzahl der E. gracilis-Zellen über vier Tage der Kultivierung weiter an, von etwa 241 Zellen/μl auf 1936 Zellen/μl. Darüber hinaus stieg die Biomasse der E. gracilis-Zellen schnell von 2,4 mg/ml auf 8,5 mg/ml. Der plötzliche Rückgang am dritten Tag könnte auf einen Messfehler zurückzuführen sein.

ein Vergleich des Volumens von E. gracilis-Zellen innerhalb von viertägigen Experimenten. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. b Statistische Analyse der Zellproliferation und Biomasseakkumulation von E. gracilis-Zellen. c Zeitlicher Verlauf der Änderungen der elektrischen Durchmesser von E. gracilis-Zellen bei vier Detektionsfrequenzen (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz und 10 MHz). d Zeitlicher Verlauf der Veränderungen der elektrischen Opazität von E. gracilis-Zellen

Für die Impedanzcharakterisierung einzelner Zellen (siehe Abb. 4c) wurden alle dielektrischen Eigenschaften von E. gracilis-Zellen unter Verwendung der dielektrischen Eigenschaften von 10-μm-Perlen kalibriert. Über einen viertägigen Kultivierungszeitraum stieg der elektrische Durchmesser der Zellen bei 500 kHz von etwa 10,89 auf 11,46. Dies liegt daran, dass der Wert der Niederfrequenzimpedanz vom Zellvolumen abhängt: Ein Anstieg der elektrischen Durchmesser im Niederfrequenzbereich weist auf eine Zunahme des Zellvolumens hin8,18,19,24,25. Bei der höchsten Erkennungsfrequenz (10 MHz) kann der Strom die Zellmembran frei durchdringen und sich im Zytoplasma zwischen intrazellulären Komponenten (z. B. Paramylon und Chloroplasten) ausbreiten, wodurch der elektrische Hochfrequenzdurchmesser mit der intrazellulären nichtleitenden Biomasse des Individuums in Beziehung gesetzt werden kann Zellen. Daher deuten Anstiege sowohl des Niederfrequenz- als auch des Hochfrequenzdurchmessers darauf hin, dass es in den ersten beiden Tagen zu leichten Anstiegen des Volumens und der Biomasse kam.

In Abb. 4d ist die elektrische Opazität der Zellen (Tage 1–4) nahezu identisch mit der der Vorkulturen (Tag 0), da die neuen Kultivierungsbedingungen mit den Vorkulturbedingungen identisch sind. Am ersten Tag kam es jedoch zu einem Anstieg des elektrischen Durchmessers bei hohen Frequenzen (d. h. 7–10 MHz), und zwar früher als am zweiten Tag zu einem Anstieg des elektrischen Durchmessers bei niedrigen Frequenzen (d. h. 500 kHz) (siehe). Abb. 4c). Dies kann daran liegen, dass bei der Übertragung der E. gracilis-Zellen in ein frisches Medium ausreichend organische Nährstoffe und anorganische Ionen die Bildung intrazellulärer Komponenten vor der Zellvermehrung induzierten. Im Detail kann die Proliferationsrate von E. gracilis-Zellen durch die Ionen Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+, Co2+ und Ni2+ im Medium26 beschleunigt werden, und die Zellvermehrung erfolgt etwas später als die Chloroplastenvermehrung. Bei E. gracilis-Zellen ist die Anzahl der Chloroplasten in jeder Zelle relativ stabil und schwankt zwischen 10 und 2027. Wenn 60 oder mehr Chloroplasten pro Zelle vorhanden sind, findet normalerweise eine Zellvermehrung statt28,29. Daher können E. gracilis-Zellen vor ihrer Vermehrung eine zunehmende intrazelluläre Biomasse aufweisen, was zu einem etwas früheren Anstieg der elektrischen Hochfrequenzdurchmesser im Vergleich zu den elektrischen Niederfrequenzdurchmessern führt.

Obwohl einige anorganische Metallionen für das Zellwachstum von E. gracilis erforderlich sind und während der Biomassesynthese stabilisiert werden26,30, können die organischen Vorräte in der natürlichen Umgebung unzureichend sein. Daher müssen E. gracilis-Zellen photoautotroph wachsen und der Großteil ihrer Biomasse muss durch Photosynthese unter Verwendung von Kohlendioxid aus der Luft als Kohlenstoffquelle erzeugt werden31,32. Um die Auswirkungen anorganischer Ionen auf das Zellwachstum und die Biomasseakkumulation zu analysieren, wurden E. gracilis-Zellen als Kontrolle in einer 1 × PBS-Lösung kultiviert. Die dielektrischen Eigenschaften, die Zellvermehrung und die Biomasseakkumulation der in PBS und Cramer-Myers (CM)-Medium kultivierten E. gracilis-Zellen werden verglichen und in Abb. 5 dargestellt.

ein Vergleich des Volumens von E. gracilis-Zellen während viertägiger Experimente. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. b Statistische Analyse der Zellproliferation und Biomasseakkumulation von E. gracilis-Zellen. c Zeitlicher Verlauf der Änderungen der elektrischen Durchmesser von E. gracilis-Zellen bei vier Detektionsfrequenzen (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz und 10 MHz). d Zeitlicher Verlauf der Veränderungen der elektrischen Opazität von E. gracilis-Zellen

Ohne organische Kohlenstoffquellen im Wachstumsmedium sind die über vier Tage in PBS und CM-Medium kultivierten E. gracilis-Zellen in Abb. 5a dargestellt. Aufgrund der begrenzten Kohlenstoffquellen in der Luft war die resultierende Paramylon-Synthese eingeschränkt. Als die E. gracilis-Zellen in CM-Medium und PBS-Lösung überführt wurden, begannen die Zellen, gespeicherte Energie (Paramylon) zu verbrauchen, was zu einer Verringerung der Biomasse führte. Darüber hinaus ist in Abb. 5b der Einfluss anorganischer Ionen auf das Zellwachstum dargestellt. Trotz unzureichender Kohlenstoffquellen teilten sich die E. gracilis-Zellen im CM-Medium häufiger als die in PBS-Lösung. Dieses Ergebnis stützte auch mehrere Forschungsschlussfolgerungen hinsichtlich der fördernden Wirkung anorganischer Ionen auf die Zellvermehrung von E. gracilis33,34,35.

Obwohl im CM-Medium mehr Zellen vorhanden waren als im PBS-Medium, waren die Biomassen der Zellen in beiden Fällen nahezu gleich. Mit anderen Worten: Die einzelnen in CM-Medium kultivierten Zellen weisen möglicherweise weniger Biomasse auf als die in PBS-Lösung kultivierten Zellen. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Impedanzerkennung weiter bestätigt, wie in Abb. 5c dargestellt. Nach vier Tagen Kultivierung waren die elektrischen Durchmesser der E. gracilis-Zellen in PBS-Lösung bei vier Nachweisfrequenzen größer als die der Zellen in CM-Medium. Dies deutete darauf hin, dass die E. gracilis-Zellen in PBS-Lösung im Vergleich zu den in CM-Medium kultivierten Zellen aufgrund eines größeren elektrischen Niederfrequenzdurchmessers ein größeres Volumen und aufgrund einer höheren elektrischen Opazität dichtere intrazelluläre Komponenten aufwiesen (siehe Abb. 5d).

Darüber hinaus sind auch die elektrischen Durchmesser und elektrischen Opazitäten der Zellen gute Indikatoren für die Veränderung des Kultivierungsmediums. Als die E. gracilis-Zellen in frisches Kultivierungsmedium überführt wurden, nahmen der elektrische Durchmesser und die Opazität der Zellen, insbesondere in PBS-Lösung, am ersten Tag der Kultivierung rapide ab, was mit den Veränderungen der Osmose und des pH-Werts der Zellen in Zusammenhang stehen kann das Kultivierungsmedium. Nach zwei Tagen der Anpassung an diese neuen Umgebungen normalisierten sich die elektrische Opazität und der Durchmesser der E. gracilis-Zellen wieder.

Unter Berücksichtigung der Wachstumsbedingungen der E. gracilis-Zellen in CM-Medium, KH-Medium und PBS-Lösung kamen wir zu dem Schluss, dass einige anorganische Ionen zur Zellvermehrung beitragen könnten. Besonders wenn E. gracilis-Zellen in einer Umgebung mit ausreichend organischen und anorganischen Quellen gezüchtet werden, erreichen ihre Proliferationsrate und Zellbiomasseproduktivität ihre Maximalwerte. Anorganische Ionen können sich in den Zellen ansammeln36,37 und die resultierende Biomasse ist als Quelle für Biodiesel wertvoll.

In dieser Arbeit haben wir eine Methode vorgeschlagen, die die Verteilung des Neigungsniveaus von Impedanzimpulsen nutzt, um zu bestimmen, ob die Erkennungsfrequenz ausreicht, um Zellmembranen zu durchdringen. Bei hohen Detektionsfrequenzen könnte die intrazelluläre Komponentenverteilung die Impedanzimpulse neigen, was in Simulationen und Experimenten bestätigt wurde. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass bei elektrischer Durchdringung der Zellmembran die Verteilung des Neigungsindex mit zunehmender Erkennungsfrequenz allmählich dezentralisiert wird. Untersuchungen haben ergeben, dass eine Erkennungsfrequenz von 7 MHz ausreicht, um die Zellmembran von E. gracilis-Zellen zu durchdringen.

In lebenden E. gracilis-Zellen gibt es zwei Arten intrazellulärer Komponenten, die den größten Teil der Biomasse ausmachen, nämlich Paramylon und Chloroplasten. Paramylon macht als Biodieselquelle38,39 mehr als 50 % (Gew./Gew.) des Trockengewichts einzelner E. gracilis-Zellen aus40. Eine weitere Quelle für Biodiesel ist die Membran von Chloroplasten, die etwa 22 % der Biomasse ausmacht. Als umweltfreundliche und nachhaltige Alternative hat Biomasseenergie sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie großes Interesse geweckt4,41. In Japan beispielsweise wurde Biodiesel aus Zellen der Mikroalge Euglena gracilis (E. gracilis) in Shuttlebussen und Verkehrsflugzeugen als „erneuerbarer Kraftstoff der nächsten Generation“42 eingesetzt. Da Mikroalgenzellen heterogen sind und ihre Biomasseproduktivität je nach Wachstumsbedingungen variiert, sind effiziente Techniken zur Überwachung der Biomasseakkumulation während Kultivierungsprozessen erforderlich. In dieser Arbeit zeigte unsere Studie, dass die Impedanzzytometrie zur Analyse der Zellmorphologie sowie der intrazellulären Komponenten von E. gracilis-Zellen geeignet ist. Darüber hinaus werden in Zukunft auch Säugetierzellen und andere Zelltypen analysiert, die für die Biomedizin und die Umwelt von Bedeutung sind.

Bei den intrazellulären Komponenten von E. gracilis-Zellen sind einzelne Paramylonmoleküle von einer Biomembran umhüllt und weisen häufig einen hohen Grad an Kristallinität auf, was theoretisch zum hohen Stromwiderstand beiträgt33,43. Chloroplasten sind Doppelmembranorganellen, die bei gleicher Nachweisfrequenz einen höheren Stromwiderstand im Vergleich zu einer Einzelmembranzelle ergeben. Für die Beurteilung der intrazellulären Biomasse ist es notwendig, die Nachweisfrequenz zu bestimmen, mit der das Zellinnere erfasst werden kann. In dieser Arbeit haben wir berichtet, dass 7 MHz ausreichen, um die Zellmembran von E. gracilis-Zellen zu durchdringen. Allerdings sind die dielektrischen Eigenschaften verschiedener Organellen und Biomoleküle noch unbekannt. Nach dem vereinfachten numerischen Modell können intrazelluläre Komponenten bei 10 MHz polarisiert werden, in Experimenten reicht diese Frequenz jedoch nicht aus. Folglich erfordern die dielektrischen Parameter intrazellulärer Komponenten zusätzliche Untersuchungen für eine genauere Simulation.

Die Multifrequenz-Impedanzzytometrie wird häufig zur Erkennung und Analyse einzelner Zellen eingesetzt5,8,44. Darüber hinaus ist bekannt, dass hochfrequente Impedanzwerte mit intrazellulären Komponenten zusammenhängen, da sich hochfrequente Ströme durch die Zellmembran ausbreiten können24. Da die Stromausbreitung in Zellen nicht sichtbar ist, fehlt uns eine direkte Methode zur Bestimmung, ob die Erkennungsfrequenz für die Messung von Zellinnenkomponenten geeignet ist. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, dass die Verteilung intrazellulärer Komponenten verwendet werden kann, um die elektrische Penetration der Zellmembran zu bestimmen. Insbesondere wenn die elektrische Durchdringung der Membran erfolgt, nimmt die Dezentralisierung der Neigungsindexverteilung mit zunehmender Erkennungsfrequenz zu. Dies liegt daran, dass die Zellinnenräume heterogener sind als ihre Morphologien in einer Population. Heterogene interne Strukturen würden zu einer zunehmenden Dezentralisierung des Tilt-Index führen.

Hier verwendeten wir eine Niederfrequenzimpedanz, um eine Leistungsanalyse der Morphologie und des Volumens einzelner Zellen durchzuführen, und eine Hochfrequenzimpedanz, um die intrazelluläre Biomasse zu charakterisieren. Der Erkennungsmechanismus wird durch zahlreiche frühere Arbeiten gestützt. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass die Niederfrequenzerkennung zur Analyse der Zellmorphologie geeignet ist, da sich der Niederfrequenzstrom hauptsächlich um die Zelle herum ausbreitet13,18,19. Die Abhängigkeit der Niederfrequenzimpedanz vom Zellvolumen wurde ebenfalls bestätigt8. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Hochfrequenzimpedanz zur Analyse der Menge19, Verteilung18 und Dichte19,45 intrazellulärer Komponenten verwendet werden kann. Dabei basiert die impedanzbasierte Biomasseanalyse auf der Anwendbarkeit der Hochfrequenzimpedanz zur Überwachung der Menge und Dichte intrazellulärer Komponenten, was auch durch experimentelle Ergebnisse nachgewiesen wurde.

Schließlich hat sich gezeigt, dass die vorgeschlagene impedanzbasierte Plattform zur Bewertung der Auswirkungen der Kulturbedingungen auf das Zellwachstum (Volumen, Opazität und Anzahl) von E. gracilis und die Biomasseakkumulation anwendbar ist. Hochfrequente Impedanzgrößen (≥7 MHz) können zur Charakterisierung der Biomasseakkumulation eingesetzt werden, und niederfrequente Impedanzgrößen (≤4 MHz) ermöglichen die Quantifizierung des Volumens einzelner Zellen. Die Veränderungen der Biomasseakkumulation und -kultivierung in verschiedenen Medien wurden über vier Tage hinweg erfolgreich überwacht. Zukünftig schlagen wir vor, die Anwendung des Neigungsindex auf Säugetierzellen auszudehnen, um Veränderungen der Membraneigenschaften im Hinblick auf Zellalterung, Karzinogenese oder Lyse zu verfolgen.

Experimente wurden an E. gracilis NIES-48-Zellen durchgeführt, die von der Microbial Culture Collection am National Institute for Environmental Studies (NIES, Japan) bereitgestellt wurden. Die Kulturen wurden in Kulturröhrchen mit einem Arbeitsvolumen von jeweils 13 ml unter kontinuierlicher Beleuchtung (warmweiß, 130–150 μmol/m2/s) bei 28 °C gezüchtet. Um die Auswirkungen organischer Nährstoffe auf die Biomasse und die Metabolisierung einzelner Zellen zu untersuchen, wurden E. gracilis-Zellen photomixotrop unter Verwendung von KH-Medium (pH: 3,5)46 gezüchtet. Um die Auswirkungen anorganischer Ionen auf das Zellwachstum zu untersuchen, wurden E. gracilis-Zellen photoautotroph unter Verwendung von CM-Medium (pH: 3,9)47 kultiviert. E. gracilis-Zellen wurden unter Verwendung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH: 6,9) als Kontrollgruppe kultiviert. Die detaillierten Komponenten der CM- und KH-Medien wurden von Wang et al.35 beschrieben. Kurz gesagt enthält das CM-Medium keine organischen Kohlenstoffquellen, wohingegen das KH-Medium Glucose und verschiedene organische Säuren und Aminosäuren als Kohlenstoffquellen enthält48. Sowohl KH- als auch CM-Medien enthalten hohe Konzentrationen an anorganischen Ionen wie Zn2+, Mn2+, Fe3+, Cu2+, Co2+ und Ni2+, von denen einige die Biomasseakkumulation und -vermehrung von E. gracilis-Zellen fördern können36,49.

Zur Kalibrierung wurden 10 μm große Polystyrolkügelchen (Polysciences, USA) als Referenzpartikel verwendet, da sie aufgrund ihrer frequenzunabhängigen physikalischen Eigenschaften als perfekte Isolatoren gelten können. Theoretisch sollten die Größen der Vierfrequenzimpedanzen der Perlen identisch sein44.

Alle Proben wurden auf 1×PBS übertragen und mit einer Spritzenpumpe (NIHON KOHDEN CFV-3200) in mikrofluidische Geräte injiziert. Die Probenflussrate betrug 4,5 μL/min, was in dieser Arbeit zu einem Durchsatz von etwa 1250 Proben/s für die Impedanzerkennung führte. Im Allgemeinen wurden drei Wiederholungen jedes Experiments durchgeführt, dh in Abb. S3 gab es drei Zellkulturgruppen für jeden Zellkulturzustand.

Die Experimente wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen (dh 0–4 Tage) für das CM-Medium, das KH-Medium und die 1×PBS-Lösung durchgeführt, wobei jede Gruppe drei unabhängige Kulturen von E. gracilis zur robusten Charakterisierung enthielt. Das Wachstum von E. gracilis-Zellen wurde anhand der Zellzahl, des Trockengewichts, des Zellvolumens und der Opazität analysiert. Hierin wurde das Trockengewicht von E. gracilis-Zellen anhand von 0,4 ml Kulturen bestimmt, die mehr als 4 Stunden und 50 Minuten bei 100 °C getrocknet wurden. Das Volumen der Zellen wurde mithilfe niederfrequenter elektrischer Durchmesser (\(\left| {Z_{LF}} \right|^{1/3}\)) und das Volumen intrazellulärer Komponenten mithilfe hochfrequenter Messungen bestimmt elektrische Durchmesser (\(\left| {Z_{HF}} \right|^{1/3}\))18. Die Farbveränderungen in den Kulturröhrchen über vier Tage sind in Abb. S3 in den Zusatzinformationen dargestellt, wobei die grüne Farbe in den Kulturröhrchen mit zunehmender Zellzahl dunkler wird.

Der Mikrokanal aus Polydimethylsiloxan (PDMS) im Detektionsbereich ist 40 μm breit und 35 μm tief. Der Kanal wird über zwei Paar koplanarer Elektroden platziert, wobei jedes Paar aus einer Quellen- und einer Detektionselektrode besteht (Abmessungen: 30 μm breit, 30 μm Kante-zu-Kante-Spanne und 80 μm Paarspanne). Jede Elektrode ist mit einer 70 nm dicken Schicht aus Gold (Au) über einer 70 nm dicken Schicht aus Chrom (Cr) beschichtet. Der vollständige Herstellungsvorgang wurde in unserer vorherigen Arbeit ausführlich beschrieben13,18.

Wie in Abb. 1c gezeigt, wurde ein Lock-In-Verstärker auf Basis eines feldprogrammierbaren Gate-Arrays (FPGA) (Diligent Eclypse Z7, USA) verwendet, um ein 1-V-Wechselstromsignal (AC) bei vier Erkennungsfrequenzen (d. h. 500) zu erzeugen kHz, 4 MHz, 7 MHz und 10 MHz) und führen die Echtzeitverarbeitung der Impedanzsignale13,20 aus dem Erkennungsbereich durch. Die Stromsignale zweier Detektionselektroden wurden mit selbst entwickelten Transimpedanzverstärkern (I/V-Wandlern) in Spannungssignale umgewandelt und anschließend mit Differenzverstärkern (Diff) verglichen. Die resultierende Differenzspannung wurde auf der FPGA-Platine weiterverarbeitet, um die entsprechenden Impedanzsignale zu erhalten. Alle Impedanzsignale wurden mit einer Abtastrate von 62,5 kHz unter Verwendung eines Datenerfassungsgeräts (USB-6363 BNC, National Instruments, USA) aufgezeichnet und über NI DAQExpress (National Instruments, USA) in Echtzeit auf einem Computer angezeigt. Die experimentellen Schritte zur Verwendung dieses Geräts zur Impedanzerkennung sind in Abb. S4 in den Zusatzinformationen dargestellt. In Abb. 1d zeigt der Frequenzgang des I/V-Wandlers seine Fähigkeit, Stromsignale von bis zu 18,48 MHz stabil umzuwandeln. Wenn die Erkennungsfrequenz größer als 10 MHz war, begann der Verstärkungsfaktor (Gewinn) zu sinken.

Die Impedanzsignale wurden mithilfe benutzerdefinierter Skripte verarbeitet, die in MATLAB (Version 2021b, MathWorks, USA) geschrieben wurden. Die Impedanz (|Z|) jeder Perle oder E. gracilis-Zelle wurde mithilfe einer Einzelpeak-Gauß-Anpassung bestimmt, um die Spitzensignalamplitude für jede angelegte Frequenz zu extrahieren. Die mittleren Impedanzgrößen der 10 μm-Kügelchen bei vier Frequenzen wurden automatisch bestimmt und dann zur Kalibrierung der elektrischen Durchmesser der E. gracilis-Zellen verwendet. Die mittlere elektrische Opazität (|ZHF|/|Z500kH|) und der Durchmesser (\(\left| Z \right|^{1/3}\)) von E. gracilis-Zellen wurden unter Verwendung einzelner linearer Multiplikatoren normalisiert, um den Mittelwert sicherzustellen Die Werte beider Impedanzparameter der Perlen lagen bei jeder Frequenz bei Opazität = 1 und Durchmesser = 10. Darüber hinaus können die Morphologie und die intrazelluläre Verteilung der E. gracilis-Zellen bei niedrigen bzw. hohen Frequenzen mithilfe des Neigungsindex (TLeft⁄TRight − 1) durch Vergleich der Zeitspanne der linken und rechten Hälfte (TLeft⁄TRight) beurteilt werden ) der Impedanzimpulse18.

Zangle, TA, Burnes, D., Mathis, C., Witte, ON & Teitell, MA Quantifizierung von Biomasseveränderungen einzelner CD8+ T-Zellen während antigenspezifischer Zytotoxizität. PLOS ONE 8, e68916 (2013).

Artikel Google Scholar

Rhind, N. Zellgrößenkontrolle. Curr. Biol. 31, R1414–R1420 (2021).

Artikel Google Scholar

Petrus, L. & Noordermeer, MA Biomasse zu Biokraftstoffen, eine chemische Perspektive. Grün. Chem. 8, 861–867 (2006).

Artikel Google Scholar

Sindhu, R. et al. Biokraftstoffproduktion aus Biomasse: Auf dem Weg zu einer nachhaltigen Entwicklung. Aktuelle Entwicklungen in der Biotechnologie. und Bioeng: Abfallbehandlung. Prozesse zur Energieerzeugung 79–92 (2019) https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64083-3.00005-1.

Mikami, H. et al. Virtuell einfrierende Fluoreszenzbildgebungs-Durchflusszytometrie. Nat. Komm. 11, 1162 (2020).

Artikel Google Scholar

Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K. & Goda, K. Hochdurchsatz-Raman-Durchflusszytometrie und darüber hinaus. Acc. Chem. Res. 54, 2132–2143 (2021).

Artikel Google Scholar

Ota, N. et al. Isolierung einzelner Euglena gracilis-Zellen durch Glasmikrofluidik zur Raman-Analyse der Paramylon-Biogenese. Anal. Chem. 91, 9631–9639 (2019).

Artikel Google Scholar

Honrado, C., Bisegna, P., Swami, NS & Caselli, F. Einzelzell-Mikrofluidik-Impedanzzytometrie: Von Rohsignalen zu Zellphänotypen mithilfe von Datenanalysen. Labor auf einem Chip (2021) https://doi.org/10.1039/d0lc00840k.

Zhong, J., Liang, M. & Ai, Y. Partikelcharakterisierung mit Submikronpräzision in der mikrofluidischen Impedanzzytometrie mit doppelten Differentialelektroden. Labor auf einem Chip (2021) https://doi.org/10.1039/D1LC00481F.

Kim, J., Li, B., Scheideler, OJ, Kim, Y. & Sohn, LL Viskoknoten-Porenerkennung: eine mikrofluidische Rheologieplattform zur Charakterisierung viskoelastischer Eigenschaften von Epithelzellen. iScience 13, 214–228 (2019).

Artikel Google Scholar

Haandbæk, N., Bürgel, SC, Rudolf, F., Heer, F. & Hierlemann, A. Charakterisierung einzelner Hefezellphänotypen mittels mikrofluidischer Impedanzzytometrie und optischer Bildgebung. ACS Sens. 1, 1020–1027 (2016).

Artikel Google Scholar

Petchakup, C., Li, H. & Hou, HW Fortschritte in der Einzelzellimpedanzzytometrie für biomedizinische Anwendungen. Mikromaschinen (Basel) 8, (2017).

Tang, T. et al. Mikroskopische Impedanzzytometrie zur Quantifizierung der Form einzelner Zellen. Biosens. und Bioelektron. 113521 (2021) https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113521.

Xu, Y. et al. Ein Überblick über Impedanzmessungen ganzer Zellen. Biosens. Bioelektron. 77, 824–836 (2016).

Artikel Google Scholar

Zhao, Y. et al. Entwicklung der mikrofluidischen Impedanzzytometrie zur Quantifizierung der spezifischen Membrankapazität und Zytoplasmaleitfähigkeit aus 100.000 Einzelzellen. Biosens. Bioelektron. 111, 138–143 (2018).

Artikel Google Scholar

Sui, J., Foflonker, F., Bhattacharya, D. & Javanmard, M. Elektrische Impedanz als Indikator für die Gesundheit von Mikroalgenzellen. Wissenschaft. Rep. 10, 1–9 (2020).

Artikel Google Scholar

Zhong, J., Li, P., Liang, M. & Ai, Y. Markierungsfreier Zelllebensfähigkeitstest und Anreicherung kryokonservierter Zellen mittels mikrofluidischer Zytometrie und On-Demand-Sortierung. Adv. Mater. Technol. 2100906 (2021) https://doi.org/10.1002/ADMT.202100906.

Tang, T. et al. Zweifrequenz-Impedanztests für intrazelluläre Komponenten in Mikroalgenzellen. Labor auf einem Chip (2022) https://doi.org/10.1039/D1LC00721A.

Tang, T. et al. Impedanzbasierte Verfolgung des Verlusts intrazellulärer Komponenten in Mikroalgenzellen. Sens. Aktoren B: Chem. 358, 131514 (2022).

Artikel Google Scholar

Tang, T. et al. FPGA-unterstützte nichtparallele Impedanzzytometrie als Ortungssensor für einzelne Partikel. im Jahr 2021 21. Int Conf. zu Halbleitersensoren, Aktoren und Microsyst. (Wandler) 727–730 (IEEE, 2021). https://doi.org/10.1109/Transducers50396.2021.9495657.

Fernandez-de-Cossio-Diaz, J. & Mulet, R. Maximale Entropie und Populationsheterogenität in kontinuierlichen Zellkulturen. PLOS Computational Biol. 15, e1006823 (2019).

Artikel Google Scholar

Thuronyi, BW et al. Kontinuierliche Weiterentwicklung der Basiseditoren mit erweiterter Zielkompatibilität und verbesserter Aktivität. Nat. Biotechnologie. 2019 37:9 37, 1070–1079 (2019).

Google Scholar

Gong, L. et al. Direkte und markierungsfreie Zellstatusüberwachung von Sphäroiden und Mikroträgern mittels mikrofluidischer Impedanzzytometrie. Klein 17, 2007500 (2021).

Artikel Google Scholar

Sun, T. & Morgan, H. Einzelzell-Mikrofluidik-Impedanzzytometrie: eine Übersicht. Microfluidics Nanofluidics 8, 423–443 (2010).

Artikel Google Scholar

Han, Anal. Chem. 84, (2012).

Ochi, H. Bedarf und Akkumulation anorganischer Ionen in Euglena gracilis ZJ Jpn. Soc. Nutr. Lebensmittelwissenschaft. 43, 54–57 (1990).

Nigon, V. & Heizmann, P. Morphologie, Biochemie und Genetik der Plastidenentwicklung in Euglena gracilis. in 211–290 (1978). https://doi.org/10.1016/S0074-7696(08)62243-3.

Cook, JR Unausgeglichenes Wachstum und Replikation von Chloroplastenpopulationen in Euglena gracilis. J. Gen. Microbiol. 75, 51–60 (1973).

Artikel Google Scholar

DAVIS, E. & EPSTEIN, H. Einige Faktoren, die die schrittweise Variation der Organellenzahl in steuern. Exp. Zellauflösung 65, 273–280 (1971).

Artikel Google Scholar

Khatiwada, B. et al. Untersuchung der Rolle der Chloroplasten bei der Schwermetalltoleranz und -akkumulation in Euglena gracilis. Mikroorg. 8, 115 (2020).

Artikel Google Scholar

Yan, R., Zhu, D., Zhang, Z., Zeng, Q. & Chu, J. Kohlenstoffstoffwechsel und Energieumwandlung von Synechococcus sp. PCC 7942 unter mixotrophen Bedingungen: Vergleich mit photoautotrophen Bedingungen. J. Appl. Phykol. 4, 657–668 (2012).

Artikel Google Scholar

Beardall, J. & Raven, JA Grenzen des phototrophen Wachstums in dichter Kultur: CO2-Versorgung und Licht. Algen für Biokraftstoffe und Energie. 91–97 (2013) https://doi.org/10.1007/978-94-007-5479-9_5.

Gissibl, A., Sun, A., Care, A., Nevalainen, H. & Sunna, A. Bioprodukte aus Euglena gracilis: Synthese und Anwendungen. Vorderseite. in Bioingenieurwesen und Biotechnologie. 7, 2296–4185 (2019).

Einicker-Lamas, M. et al. Euglena gracilis als Modell für die Untersuchung der Toxizität und Akkumulation von Cu2+ und Zn2+ in eukaryotischen Zellen. Umgebung. Umweltverschmutzung. 120, 779–786 (2002).

Artikel Google Scholar

Wang, Y., Seppänen-Laakso, T., Rischer, H. & Wiebe, MG Wachstum und Zellzusammensetzung von Euglena gracilis unter verschiedenen Temperatur-, Licht- und trophischen Bedingungen. PLoS ONE 13, 1–17 (2018).

Matsumoto, T., H. Inui, K. Miyatake, Nakano, Y. & Murakami, K. Vergleich der Nährstoffe in Euglena mit denen in anderen repräsentativen Nahrungsquellen. Öko-Ing. 21, 81–86 (2009).

Google Scholar

Guedes, AC & Malcata, FX Nährwert und Verwendung von Mikroalgen in der Aquakultur. Aquakultur 10, 59–78 (2012).

Google Scholar

Matos, Â. P. Der Einfluss von Mikroalgen in der Lebensmittelwissenschaft und -technologie. Marmelade. Soc. der Ölchemiker 94, 1333–1350 (2017).

Artikel Google Scholar

Furuhashi, T. et al. Profilierung von Wachsestern und lipophilen Verbindungen von Euglena gracilis durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie: zum Verständnis der Wachsesterfermentation unter Hypoxie. Metabolomics 11, 175–183 (2014).

Artikel Google Scholar

Sun, A., Hasan, MT, Hobba, G., Nevalainen, H. & Te'o, J. Vergleichende Bewertung der Euglena gracilis var. Saccharophila-Variantenstamm als Produzent des β-1,3-Glucan-Paramylons unter variierenden Lichtbedingungen. J. Phycol. 54, 529–538 (2018).

Artikel Google Scholar

Tilman, D., Hill, J. & Lehman, C. Kohlenstoffnegative Biokraftstoffe aus Grünlandbiomasse mit geringem Input und hoher Diversität. Science (1979) 314, 1598–1600 (2006).

Google Scholar

Kottuparambil, S., Thankamony, RL & Agusti, S. Aubergine als potenzielle natürliche Quelle von Mehrwertmetaboliten. Eine Rezension. Algenres. 37, 154–159 (2019).

Artikel Google Scholar

Barsanti, L., Passarelli, V., Evangelista, V., Frassanito, AM & Gualtieri, P. Chemie, physikalische Chemie und Anwendungen im Zusammenhang mit biologischen Aktivitäten von β-Glucanen. Nat. Prod. Rep. 28, 457 (2011).

Artikel Google Scholar

Spencer, D. & Morgan, H. Hochgeschwindigkeits-Einzelzellen-Dielektrikumsspektroskopie. ACS Sens. 5, 423–430 (2020).

Artikel Google Scholar

Salahi, A., Honrado, C., Rane, A., Caselli, F. & Swami, NS Modifizierte rote Blutkörperchen als multimodale Standards für das Benchmarking der Einzelzellzytometrie und -trennung auf der Grundlage elektrischer Physiologie. Anal. Chem. 94, 2865–2872 (2022).

Koren, LE Hochertragsmedien für die Photosynthese Euglena gracilis ZJ Portozool 14, 17 (1967).

Google Scholar

Cramer, M. & Myers, J. Wachstum und photosynthetische Eigenschaften von Euglena gracilis. Bogen. Fell. Mikrobiologie 17, 384–402 (1952).

Artikel Google Scholar

Muramatsu, S. et al. Isolierung und Charakterisierung einer motilitätsdefekten Mutante von Euglena gracilis. PeerJ 8, e10002 (2020).

Artikel Google Scholar

Cousins, RJ Eine Rolle von Zink bei der Regulierung der Genexpression. Proz. Nutr. Soc. 57, 307–311 (1998).

Artikel Google Scholar

Kamalanathan, M., Chaisutyakorn, P., Gleadow, R. & Beardall, J. Ein Vergleich des photoautotrophen, heterotrophen und mixotrophen Wachstums für die Biomasseproduktion durch die Grünalge Scenedesmus sp. (Chlorophyceen). https://doi.org/10.2216/17-82.157, 309–317 (2019).

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Diese Arbeit wird vom JSPS Core-to-Core-Programm unterstützt; JSPS-Stipendium für wissenschaftliche Forschung (Nr. 20K15151); Amada Foundation, Japan; Sasakawa Scientific Research Grant, Japan; NSG Foundation, Japan; White Rock Foundation, Japan; Discovery Project des Australian Research Council (ARC) (DP200102269), Australien; und die Nara Institute of Science and Technology Support Foundation, Japan; JST-Unterstützung für bahnbrechende Forschung, initiiert durch das Next Generation-Programm und das Touch-Stone-Programm des Nara Institute of Science and Technology.

Abteilung für Materialwissenschaften, Nara Institute of Science and Technology, 8916-5 Takayama-cho, Ikoma, Nara, 630-0192, Japan

Tao Tang, Xun Liu, Tianlong Zhang, Ryota Kiya, Yoichiroh Hosokawa und Yaxiaer Yalikun

Zentrum für Biosystemdynamikforschung (BDR), RIKEN, 1-3 Yamadaoka, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Yapeng Yuan, Yo Tanaka und Yaxiaer Yalikun

School of Engineering, Macquarie University, Sydney, 2109, NSW, Australien

Tianlong Zhang & Ming Li

Institut für Tiefseewissenschaft und -technik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Sanya, Hainan, 572000, VR China

Yang Yang

Euglena Co. Ltd., Tokio, 108-0014, Japan

Kengo Suzuki

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Korrespondenz mit Yaxiaer Yalikun.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tang, T., Liu, X., Yuan, Y. et al. Beurteilung der elektrischen Penetration von Zellmembranen mittels Vierfrequenz-Impedanzzytometrie. Microsyst Nanoeng 8, 68 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

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Eingegangen: 09. Februar 2022

Überarbeitet: 16. Mai 2022

Angenommen: 30. Mai 2022

Veröffentlicht: 24. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

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