3D-Streumikrophantomprobe zur Beurteilung der quantitativen Genauigkeit in tomographischen Phasenmikroskopietechniken

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19586 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In diesem Artikel stellen wir eine strukturell komplexe biomimetische Streustruktur vor, die durch Zwei-Photonen-Polymerisation hergestellt wurde, und nutzen dieses Objekt, um ein rechnergestütztes Bildgebungssystem zu bewerten. Das Phantom ermöglicht eine maßgeschneiderte Streuung durch Modifizierung seiner Freiheitsgrade, z. B. Brechungsindexkontrast und Streuschichtabmessungen, und beinhaltet einen 3D-Bildqualitätstest, der eine einzelne Zelle im Gewebe darstellt. Während die Probe mit mehreren 3D-Mikroskopietechniken verwendet werden kann, demonstrieren wir den Einfluss der Streuung auf drei Rekonstruktionsmethoden der tomographischen Phasenmikroskopie (TPM). Eine dieser Methoden geht davon aus, dass die Probe schwach streut, während die anderen beiden die Mehrfachstreuung berücksichtigen. Die Untersuchung wird bei zwei Wellenlängen (sichtbares und nahes Infrarot) durchgeführt, die als Skalierungsfaktor für das Streuphänomen dienen. Wir stellen fest, dass die Änderung der Wellenlänge vom sichtbaren ins nahe Infrarot die Anwendbarkeit von TPM-Rekonstruktionsmethoden beeinflusst. Aufgrund der verringerten Streuung im Nahinfrarotbereich schneiden die auf Mehrfachstreuung ausgerichteten Techniken tatsächlich schlechter ab als eine Methode, die auf Proben mit schwacher Streuung abzielt. Dies impliziert die Notwendigkeit, den richtigen Ansatz abhängig von den Streueigenschaften der Probe zu wählen, selbst bei geringfügigen Änderungen in der Objekt-Licht-Wechselwirkung.

Eine der modernen Herausforderungen in der Computeroptik besteht darin, streuende Proben mit hoher Auflösung abzubilden1. Dies kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass komplexe biologische Strukturen wie Sphäroide oder Organoide tendenziell relevantere Modelle sind als 2D-Zellkulturen, beispielsweise für die Arzneimittelentwicklung2. Außerdem erfordern die meisten In-vivo-Bildgebungstechniken, dass das Sondierungslicht die komplexe Struktur eines Gewebes durchdringt, was die Bildtiefe aufgrund der Mehrfachstreuung stark einschränkt. Dieser Bedarf regt die Entwicklung neuer Methoden an1,3,4,5, allerdings ist es schwierig, basierend auf der Streustärke der analysierten Probe eine geeignete auszuwählen. Aus diesem Grund ist eine vielseitige, wiederholbare und quantitative Methode zur Bewertung verschiedener Bildgebungssysteme und Algorithmen unerlässlich, um deren Grenzen der Anwendbarkeit in Abhängigkeit von den Streueigenschaften des Objekts zu bestimmen. Eine Möglichkeit besteht darin, kalibrierte Mikrophantome als Bildziele zu verwenden. Bedauerlicherweise sind bestehende Mikrophantome typischerweise entweder schwach streuend (z. B. Mikrokügelchen mit Indexanpassung) oder übermäßig simpel (z. B. Mikrokügelchen mit Indexfehlanpassung)6,7 im Vergleich zu den Arten heterogen streuender mehrzelliger Proben, für die Methoden mit Mehrfachstreuung gedacht sind. Dies ist eine entscheidende Einschränkung bei der Charakterisierung rechnergestützter Bildgebungsmethoden, die nichtkonvexe Löser verwenden, bei denen die iterative Konvergenz von der Komplexität der Energielandschaft abhängt und direkt mit der 3D-Komplexität einer Probe zusammenhängt8.

In dieser Arbeit präsentieren wir ein 3D-gedrucktes Mikrophantom mit mehrfach streuender Brechungsindexverteilung (RI). Dazu nutzen wir die neuesten Entwicklungen im 3D-Druck durch direktes Laserschreiben9,10,11,12. Unter den zahlreichen verfügbaren 3D-Drucktechniken13,14,15,16,17,18 haben wir eine Zwei-Photonen-Polymerisation ausgewählt, die den 3D-Druck von Mikrophantomproben mit bekannter Geometrie und kalibriertem RI ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Implementierungen des direkten Laserschreibens ermöglicht es (1) die Steuerung des RI mit einem relativ hohen Modulationsbereich, (2) die Anpassung des RI-Kontrasts oder der Streustärke nach der Herstellung unter Verwendung verschiedener Immersionsflüssigkeiten und (3) die Handhabung und Messen Sie das Mikrophantom auf die gleiche Weise wie biologische Proben. Als nächstes stellen wir die Anwendung des Phantoms im Bereich der tomographischen Phasenmikroskopie (TPM) vor, einer Technik, die in früheren Arbeiten beeindruckende biologische Bildgebungsergebnisse gezeigt hat. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass mit dem vorgeschlagenen Verfahren alle rechnergestützten Bildgebungsverfahren evaluiert werden können.

TPM ist eine quantitative, markierungsfreie Bildgebungsmethode, die optische Projektionen durch eine halbtransparente Probe entlang verschiedener Beleuchtungswinkel nutzt, um den 3D-RI der Probe zu rekonstruieren. Diese Methode hat mehrere Anwendungen in der biologischen Bildgebung gefunden, wo RI direkt mit der Trockenmassenverteilung auf zellulärer und subzellulärer Ebene zusammenhängt. Der Brechungsindex und die Trockenmasse sind bekanntermaßen entscheidende Faktoren bei der Analyse des aktuellen Stadiums des Zellzyklus19, der Zellstruktur20,21, der photobiochemischen Wirkungen auf Zellen22, des Einflusses externer Faktoren auf Zellparameter23,24 und vieler anderer. Angesichts der Fülle an Informationen, die die Trockenmasse auf Einzelzellebene liefert, besteht ein erheblicher Bedarf, die Fähigkeit zur Analyse der Trockenmasse auf große mehrzellige Cluster, dicke Gewebeschnitte oder ganze Mikroorganismen auszudehnen. Um jedoch 3D-RI zu rekonstruieren, nutzen herkömmliche TPM-Methoden in ihren rechnerischen Rekonstruktionsmethoden kritische Annahmen, die auf einer schwachen Streuung der Probe beruhen25. Diese Annahmen beschränken die Dicke der Proben auf nur einige zehn Mikrometer. Für dicke, komplexe Proben müssen Rekonstruktionsgerüste verwendet werden, die Mehrfachstreuung berücksichtigen. Zu diesem Zweck wurden in den letzten Jahren zahlreiche TPM-Ansätze vorgeschlagen, die neue Frameworks zur Berücksichtigung der Mehrfachstreuung einführen26,27,28,29,30,31. Insbesondere nutzen diese Ansätze nichtlineare und nichtkonvexe Löser, um iterativ nach dem 3D-RI einer Probe zu suchen. Obwohl diese Methoden beeindruckende Ergebnisse bei der Rekonstruktion von RI in Proben mit Mehrfachstreuung gezeigt haben, wurde ihre quantitative Genauigkeit noch nicht zuverlässig experimentell charakterisiert, und die präsentierten Ergebnisse erlauben normalerweise keinen Vergleich verschiedener Methoden, um den richtigen Ansatz für ein bestimmtes Streuniveau auszuwählen in einer Probe. Die allgemeine Strategie zur experimentellen Bewertung der quantitativen Genauigkeit von TPM-Methoden besteht darin, 3D-RI in Proben mit bekannten RI-Verteilungen zu rekonstruieren6,7,32. Von einer TPM-Methode mit Mehrfachstreuung, die genaue 3D-RI-Rekonstruktionen eines schwach streuenden oder übermäßig vereinfachten Mikrophantoms ausgibt, kann nicht erwartet werden, dass sie ähnlich genaue RI-Rekonstruktionen für komplexere Mehrfachstreuungsproben liefert, bei denen die Wahrscheinlichkeit der Konvergenz zu lokalen Minima drastisch höher ist. Um die quantitative Genauigkeit von TPM-Methoden mit Mehrfachstreuung zuverlässig zu charakterisieren, ist es zwingend erforderlich, Mikrophantome mit bekanntem 3D-RI zu verwenden, die die strukturelle Komplexität der Probentypen nachahmen, die mit den TPM-Methoden abgebildet werden sollen. Nach unserem besten Wissen gibt es diese Art von Goldstandard-Mehrfachstreu-Mikrophantomen nicht.

In diesem Abschnitt stellen wir das Design des 3D-gedruckten Mikrophantoms und seine Anwendung bei der Bewertung von drei TPM-Rekonstruktionsmethoden vor.

Das von uns entworfene und 3D-gedruckte Streumikrophantom besteht aus einem zellähnlichen Ziel mit internen Teststrukturen33, eingebettet in eine pseudozufällige Verteilung von Stäben, die ihre Ausrichtung über verschiedene Schichten hinweg ändern (Abb. 1a). Die Breite und Höhe jedes Stabes beträgt 0,5 \(\upmu\)m bzw. 1,8 \(\upmu\)m. Der seitliche Abstand zwischen den Stäben in jeder Schicht liegt zufällig zwischen 0,7 \(\upmu\)m und 3 \(\upmu\)m und die Schichten sind alle 1,4 \(\upmu\)m vertikal gestapelt. Die resultierende Struktur ist transparent (über 99 % Transmission für den Extinktionskoeffizienten von 0,1 mm\(^{-1}\)34) und mehrfach streuend35. Der endgültige Streubereich ist ein 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\) 40 \(\upmu\)m-Würfel mit einem Füllfaktor von ungefähr 25 % (vom Polymer eingenommener Volumenanteil).

(a) Halbschnittansicht des streuenden Mikrophantomdesigns. (b) REM-Aufnahme einer Streuschicht aus quasi-zufällig verteilten Stäbchen. (c) Einzelner Stab, der eine Streuschicht umfasst. (d) Visualisierung der 3D-RI-Verteilung des Bildgebungsziels – Zellphantom. Subzelluläre Merkmale wie Auflösungsziele (siehe Einschub) und Zellkerne sind in einem abgeschnittenen Ellipsoid mit den Außenabmessungen von 30 \(\upmu\)m \(\times\) 25 \(\upmu\)m \ eingeschlossen. (\times\) 12 \(\upmu\)m, der dann in der Mitte des 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\ eingebettet wird ) 40 \(\upmu\)m Streuwürfel.

Das zellähnliche Ziel, eingebettet in die Schichten zufällig verteilter Stäbchen, ahmt eine einzelne biologische Zelle nach, die in einem Streuvolumen eingeschlossen ist, das beispielsweise Gewebe darstellt. Das Zellziel besteht aus Substrukturen, die eine Beurteilung der quantitativen Genauigkeit in TPM-Bildgebungssystemen ermöglichen36. Informationen zum 3D-Druckverfahren finden Sie in Abschn. „Herstellung von 3D-Streumikrophantomen“. Zu den Hauptmerkmalen innerhalb des Zellziels gehören Auflösungstestziele, in einem Zellkern suspendierte Nukleolen und ein Bereich mit langsamer RI-Variation (siehe Abb. 1d). Bemerkenswert ist, dass das Auflösungstestziel Linien mit zunehmender Ortsfrequenz37 bis zu 1667 lp/mm umfasst. Durch die Bewertung der maximalen räumlichen Frequenz von Linien, die innerhalb des Zelltestziels unterschieden werden können, kann die Bildauflösung einer TPM-Methode Ihrer Wahl charakterisiert und möglicherweise mit verschiedenen Methoden zur Bewertung der Auflösung verglichen werden, die von anderen Forschungsgruppen beschrieben wurden38,39. Die pseudozufällige Verteilung der Stäbchen, die den Streuanteil des gesamten Mikrophantoms bilden, wird innerhalb von 0,5 \(\upmu\)m des Zellziels unterdrückt und schneidet keine der Teststrukturen. Ein Modell des Phantoms ist im Datensatz 140 verfügbar.

Drei TPM-Rekonstruktionsmethoden wurden implementiert und durch Vergleich tomographischer Rekonstruktionen des vorgeschlagenen Mikrophantoms bewertet. Die Methoden sind: (1) Gerchberg-Paopulis mit Stützbeschränkung (GPSC)41, (2) Mehrschicht-Strahlausbreitung mit elektrischen Feldmessungen (MSBP-E)42 und (3) Mehrschicht-Strahlausbreitung mit Intensität -nur Messungen (MSBP-I)31. Um den Vergleich durchzuführen, wurde das Phantom mit dem TPM-Gerät vermessen und zwei Datensätze aus den komplexwertigen Streufeldmessungen des Mikrophantoms zusammengestellt, das in verschiedenen Winkeln beleuchtet wurde, wobei sowohl die Wellenlängen 633 nm als auch 835 nm verwendet wurden. Für GPSC und MSBP-E wurden diese Datensätze direkt verwendet. Für MSBP-I wurden nur die Amplitudenkomponenten verwendet. Die Messungen und die entsprechenden 3D-RI-Rekonstruktionen sind im Datensatz 140 verfügbar.

Abbildung 2 zeigt die Rekonstruktionsergebnisse für beide Wellenlängen. Wir charakterisieren die laterale (x und y) Auflösung der TPM-Rekonstruktionen durch Visualisierung der Auflösungstestlinien im Mikrophantom. Um die drei TPM-Rekonstruktionsmethoden quantitativ zu vergleichen, wurden horizontale und vertikale Querschnittsdiagramme über diese Auflösungstests erstellt, indem der Durchschnitt und die Standardabweichung der Pixelwerte über Zeilen oder Spalten neben den gestrichelten weißen Linien aa und bb berechnet wurden \(\pm 4\) Pixel. Diese Querschnittsdiagramme sind unten dargestellt.

Vergleich tomographischer Rekonstruktionen des Mikrophantoms, gemessen mit 633 nm und 835 nm Wellenlänge und berechnet mit 3 Algorithmen. Die schattierten farbigen Bereiche rund um jedes der 1D-Diagramme unten stellen die Standardabweichung dar.

Die bekannte komplexe Geometrie und RI-Verteilung des entwickelten Mikrophantoms ermöglicht den Nachweis, dass sich die Änderung der Wellenlänge vom sichtbaren ins nahe Infrarot auf die Anwendbarkeit von TPM-Rekonstruktionsmethoden auswirkt43,44. Die vergrößerten Ansichten des Auflösungstestbereichs nach der Rekonstruktion des Mikrophantoms mithilfe des GPSC-Algorithmus mit Licht einer Wellenlänge von 633 nm zeigen erhebliche körnige Artefakte, die die Linienmerkmale innerhalb des Testbereichs des Mikrophantoms verdecken. Wir stellen fest, dass diese Artefakte bei der Rekonstruktion mit Licht der Wellenlänge 835 nm stark verringert werden. Dies deutet darauf hin, dass das Mikrophantom bei einer Wellenlänge von 633 nm zu stark streut, als dass GPSC anwendbar wäre. Die verringerten GPSC-Rekonstruktionsartefakte für 835 nm entsprechen dem herkömmlichen Wissen, dass Licht mit längeren Wellenlängen resistenter gegen Streuung ist als kürzere Wellenlängen. Um zu bestätigen, dass diese Beobachtung auf eine verringerte Streuung und nicht auf unterschiedliche Rauscheigenschaften zwischen den beiden Lichtquellen zurückzuführen ist, haben wir die Standardabweichung des Phasenrauschens in einem objektfreien Bereich innerhalb der Eingabedatensätze analysiert. Für Licht mit einer Wellenlänge von 633 nm wurde eine Phasenrausch-Standardabweichung von \(\sigma = 0,10\) im Bogenmaß beobachtet, während für Licht mit einer Wellenlänge von 835 nm eine Phasenrausch-Standardabweichung von \(\sigma = 0,08\) im Bogenmaß beobachtet wurde . Angesichts einer so geringen Variation zwischen diesen Rauscheigenschaften kommen wir zu dem Schluss, dass der Hauptfaktor in der GPSC-Rekonstruktionsqualität, der sich auf die Fähigkeit zur Visualisierung der Testlinien des Mikrophantoms auswirkt, die Streustärke des Mikrophantoms bei den beiden unterschiedlichen Wellenlängen ist.

Bemerkenswert ist, dass sowohl MSBP-E als auch MSBP-I die Total-Variation-Regularisierung (TV) verwenden, um die Konvergenz des nichtkonvexen iterativen Lösers bei Vorhandensein von Rauschen zu stabilisieren45. Insbesondere bei der Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 633 nm führt die TV-Regularisierung zu 3D-RI-Rekonstruktionen mit weniger Rauschen im Vergleich zu den über GPSC berechneten 3D-Rekonstruktionen, die keine TV-Regularisierung verwenden. Dies kann direkt in den 2D-Querschnitten in Abb. 2 visualisiert werden und wird durch die Grenzen der Standardabweichung bestätigt, die in den 1D-Querschnittsdiagrammen dargestellt sind. Der Nachteil der Regularisierung besteht jedoch darin, dass sie einen unscharfen Effekt auf hochauflösende Merkmale hat. Da das Mikrophantom im Licht der Wellenlänge 835 nm weniger streut, gelang es nur GPSC, die Testlinien mit hoher Ortsfrequenz innerhalb des Mikrophantoms zu rekonstruieren. Typischerweise wird die Stärke der TV-Regularisierung manuell angepasst, um experimentellen Faktoren gerecht zu werden und den Kompromiss zwischen dem Erreichen iterativer Stabilität und einer hohen Bildauflösung auszugleichen.

In Bezug auf den durchschnittlichen RI ermöglicht das Wissen über die Ground-Truth-RI-Verteilung des Phantoms einen quantitativen Vergleich der Rekonstruktionsergebnisse mit GPSC, MSBP-E und MSBP-I. Wir sehen, dass alle Methoden die Masseneigenschaften des Mikrophantoms erfolgreich erfassen. Wie oben beschrieben, weist die 3D-Rekonstruktion mittels GPSC körnige Artefakte auf, wenn Licht mit einer Wellenlänge von 633 nm verwendet wird, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass das Mikrophantom bei dieser Wellenlänge mehrfach streut. Darüber hinaus gibt MSBP-I leicht überschätzte RI-Werte aus und weist auch niederfrequente räumliche Artefakte auf (die bei anderen Phasenbildgebungstechniken, die nur auf Intensität basieren, beobachtet wurden46,47). Andere Arbeiten haben gezeigt, dass MSBP-I bei Verwendung teilweise kohärenter Beleuchtung eine höhere Genauigkeit aufweist, wodurch das kohärente Rauschen drastisch reduziert wird31. Zukünftige Arbeiten könnten die Wiederholung dieser Analyse für einen größeren Bereich von TPM-Rekonstruktionstechniken mit komplexeren Streumikrophantomen umfassen.

Mit den präsentierten Ergebnissen zeigen wir, dass eine Änderung der Beleuchtungswellenlänge die Streucharakteristik des Mikrophantoms beeinflusst. Obwohl das Mikrophantom bei Licht mit einer Wellenlänge von 633 nm mehrfach streut, weist es bei Licht mit einer Wellenlänge von 835 nm eine schwache Streuung auf. Dies weist natürlich darauf hin, dass die optimale Wahl der Beleuchtungswellenlänge ein Gleichgewicht zwischen Auflösung (\(\frac{\lambda }{NA}\) für Einzelprojektion) und Streustärke haben muss. Wie sich gezeigt hat, gibt es Fälle, in denen es vorteilhafter ist, anstelle der Anwendung von Mehrfachstreumethoden die Beleuchtungswellenlänge zu erhöhen (und damit die Streustärke der Probe zu verringern) und eine auf dem Fourier-Beugungssatz basierende Methode anzuwenden, die das nicht nutzt Gesamtvariationsbeschränkung. Noch grundlegender ist jedoch, dass wir gezeigt haben, dass 3D-gedruckte Mikrophantome eine quantitative Bewertung der 3D-RI-Rekonstruktionsgenauigkeit über verschiedene TPM-Methoden hinweg ermöglichen. Diese Fähigkeit ist wichtig, wenn Sie eine TPM-Methode auswählen, die für bestimmte Probenklassen und Bildgebungsbedingungen optimiert ist.

Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Entwicklung von Methoden konzentrieren, um die Streustärken von Phantomen zu quantifizieren und diese Größen mit den Streueigenschaften verschiedener Gewebetypen in Beziehung zu setzen. Im Erfolgsfall könnten wir (mit den vorgestellten Methoden) 3D-Mikrophantomstrukturen entwerfen und herstellen, um eine breite Palette biologischer Proben nachzuahmen, die von mehrzelligen Clustern bis hin zu Massengeweben und kleinen Organismen reichen. Eine andere mögliche Richtung besteht darin, Streuparameter im Phantom abzustimmen, um die Abbildungsleistung für verschiedene Techniken zu charakterisieren, die zur Abbildung in streuendes Gewebe verwendet werden, wie etwa optische Kohärenztomographie oder konfokale Reflexionsmikroskopie. Schließlich stellen wir uns vor, dass man die Flexibilität der Zwei-Photonen-Polymerisation nutzen kann, um Mikrophantome auf verschiedenen Substraten herzustellen (z. B. an der Endfläche der optischen Faser für die Probenrotationstomographie) und dabei biokompatible Harze zu verwenden (um Testziele mit den lebenden Zellen zu kombinieren). im einzelnen Messvolumen48) oder modifizieren Sie das Harz mit funktionellen Partikeln18 (z. B. um Systeme aufzunehmen, die auch die Absorption messen49,50,51,52,53).

Im Folgenden stellen wir die (1) Methodik vor, mit der wir mehrfach streuende Mikrophantome in 3D drucken; (2) das optische Design der TPM-Bildgebungssysteme, die wir verwenden, um experimentell Messungen des elektrischen Streufelds des Mikrophantoms zu sammeln; und (3) kurze theoretische Beschreibungen von drei tomografischen Algorithmen, die zur Rekonstruktion von 3D-RI aus den gemessenen Daten verwendet wurden.

Das Phantom wird mithilfe der Zwei-Photonen-Laserlithographie hergestellt, bei der ein fokussierter Laserstrahl in flüssigem Harz gescannt wird. Das Harz im Fokusvolumen des Lasers wird lokal polymerisiert. Durch Anpassen der Scan-Trajektorie und der Belichtungszeit des Laserstrahls können Sie gleichzeitig die 3D-gedruckte Geometrie (Genauigkeit in der Größenordnung von 100 nm) und den RI (Genauigkeit in der Größenordnung von \(5 \times 10^{-4}\)) steuern. , maximal \(\Delta\)RI = 0,03 innerhalb der Struktur) in drei Dimensionen. Wir verwendeten Photonic Professional GT (Nanoscribe GmbH), ausgestattet mit einem 1,3 NA 100\(\times) Mikroskopobjektiv und einem Piezo-Scantisch. Das Phantom wird im IP-Dip-Harz (Nanoscribe GmbH) auf einem #1,5H-Deckglas (Dip-in-Konfiguration54) hergestellt. Nach der Herstellung wurde die Struktur in PGMEA (Propylenglycolmonomethyletheracetat; 12 Min.) entwickelt, gefolgt von Isopropylalkohol (10 Min.) und dann geföhnt. Die vollständige Methodik zur Herstellung und Validierung der Merkmale finden Sie in unserer vorherigen Arbeit33.

Um unsere TPM-Bildgebungsexperimente durchzuführen, wurde das Mikrophantom in Zeiss Immersol 518F-Öl (RI\(_{632}\) nm = 1,5123) eingetaucht, was einen ähnlichen RI-Kontrast wie im Fall von in Kulturmedium eingetauchten Zellen liefert. Durch die Verwendung von Immersionsölen mit unterschiedlichem RI ist es möglich, die Streueigenschaften des Mikrophantoms nach der Herstellung anzupassen.

In dieser Arbeit wurde ein optisches System, wie in Abb. 3a) gezeigt, verwendet, um das Streuphantom zu untersuchen. Das System ist ein Mach-Zehnder-basiertes TPM-Mikroskop55, das in einer Konfiguration mit begrenztem Winkel mit stationärer Probe und Beleuchtung arbeitet, die mit einem Galvospiegel (Thorlabs GVS212/M)56 gedreht wird. Die Forschung wurde mit zwei Wellenlängen durchgeführt und somit gab es zwei modifizierte Versionen des vorgestellten Tomographiemikroskops. Die erste Version, \(\text {TPM}_{633}\) arbeitet mit der Wellenlänge \(\lambda =\) 633 nm und die zweite, \(\text {TPM}_{835}\) mit \(\lambda =\) 835 nm. Der Eingangsstrahl (S in Abb. 3a) wird mit einer optischen Faser geliefert, kollimiert und dann in Objekt- und Referenzarm aufgeteilt. Im \(\text {TPM}_{633}\)-System war die Lichtquelle ein Volumen-Bragg-Gitter-Laser (Necsel NovaTru Chroma 633 SLM), \(\text {S}_{633}\), der ein einziges lieferte Longitudinalmodus und bietet eine lange Kohärenzlänge. Das \(\text {TPM}_{835}\)-System nutzte eine gewobbelte Quelle (Superlum Broadsweeper BS-840-2-HP, \(\Delta \lambda\)= 800–870 nm), \(\text { S}_{835}\) auf \(\lambda =\) 835 nm eingestellt. Aufgrund der unterschiedlichen Kohärenzlänge wurde für \(\text {TPM}_{835}\)-Messungen ein zusätzliches Verzögerungsmodul im Referenzstrahl platziert. Die Strahlteilerwürfel in dieser Arbeit wurden je nach verwendeter Wellenlänge entweder für 400–700 nm oder 700–1100 nm beschichtet. Die Brennweite der Tubuslinse TL1 betrug \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 150 mm und \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 200 mm jeweils. Beide Mikroskopobjektive (MO1 und MO2) in Abb. 3 waren halbplanapochromatische, unendlich korrigierte Objektive mit 100\(\times\) NA 1,3. Die verwendete zweite Tubuslinse TL2 hatte entweder \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 200 mm oder \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 300 mm. Dies lieferte Vergrößerungen \(M_{633}=-\,48,5\) und \(M_{835}=-\,72,7\). Die im System verwendete Kamera war in beiden Fällen ein CMOS-Sensor mit 3,45 \(\mu m\) Pixelgröße (JAI BM500GE) im Fall von \(\text {CAM}_{633}\) und 5,5\(\ mu m\) Pixelgröße (Basler acA2040-180km) im Fall von \(\text {CAM}_{835}\). Die Mindestvergrößerung, die durch Pixelgröße und Wellenlänge bestimmt wird, um eine korrekte Hologrammaufnahme für jede Projektion57 sicherzustellen, beträgt \(M_{633 min}=-\,44,2\) und \(M_{835 min}=-\,53,5). \), was in beiden Fällen erfüllt ist. Ein Beispielhologramm ist in Abb. 3b dargestellt. Beide Systeme wurden so eingestellt, dass sie die Probe mit einem kreisförmigen Scanszenario (siehe Abb. 3d) im Zenitwinkel \(\theta =47^{\circ }\) beleuchten und 180 Projektionen im Abstand von \(\varphi =2^{\) lieferten. circ }\). Ein Beispiel der Phase und Amplitude, die das System bei 835 nm liefert, ist in Abb. 3c und e dargestellt.

(a) Mach-Zehnder-basiertes TPM-Messsystem. S, Lichtquelle; GM, Galvo-System; TL1 und TL2, Tubuslinsen; MO1 und MO2; Mikroskopobjektiv; SPL, Probenebene; CAM, Kamera; (b) Hologramm, aufgenommen bei axialer Beleuchtung der Probe; (c) Amplitude einer Projektion bei \(\varphi =304^{\circ }\); (d) kreisförmiges Scanszenario, das bei der Messung verwendet wird. Rotationswinkel: \(\varphi\), Zenitwinkel: \(\theta =47^{\circ }\); (e) Phase der Projektion.

Es gab drei verschiedene TPM-Rekonstruktionsmethoden zur Berechnung des 3D-RI des zum Vergleich verwendeten Mikrophantoms. Die Daten für jede Methode wurden durch die Mehrwinkelstreuungsmessungen erfasst, die wie in Abschnitt 3.1 beschrieben erfasst wurden. "Mess-System". Nachfolgend finden Sie eine kurze Beschreibung dieser Methoden. Vollständige Beschreibungen dieser Methoden finden Sie in den entsprechenden Referenzen.

Um einen Basisstandard für den Vergleich mit TPM-Rekonstruktionsalgorithmen bereitzustellen, die Modelle mit Mehrfachstreuung verwenden, rekonstruieren wir zunächst den 3D-RI des Mikrophantoms mithilfe einer TPM-Methode mit schwacher Streuung. Wir verwenden insbesondere den Gerchberg-Papoulis-Algorithmus, der um zusätzliche Einschränkungen zur Unterstützung endlicher Objekte (GPSC)41 erweitert wurde. Als Inputs dienen komplexwertige elektrische Felder, die von unseren TPM-Systemen gemessen werden. Der Vorgang erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wird eine anfängliche tomografische 3D-RI-Verteilung aus den Messungen des elektrischen Feldes mit starker Totalvariations-Regularisierung rekonstruiert. Dies wird durch die Optimierungsmethode Chambolle-Pock58 durchgeführt und mit der ASTRA Tomography Toolbox59 implementiert. Das Ergebnis wird binarisiert und eine endliche Objektunterstützung wird generiert. Zweitens wird ein klassischer Gerchberg-Papoulis-Algorithmus verwendet, der eine iterative Version der Direktinversionsmethode (auch als Wolf-Transformation bekannt)60 ist. Dieses iterative Verfahren basiert auf dem Fourier-Beugungssatz61 und nutzt die Streuungsnäherung erster Ordnung. Hier werden die Rekonstruktion und ihre Fourier-Transformation abwechselnd berechnet und Einschränkungen angewendet: Nichtnegativität und endliche Objektunterstützung im Signalbereich sowie Ergänzung der Originalprojektionen im Frequenzbereich.

Unsere Hauptmethode zur Modellierung der Mehrfachstreuung ist die Multi-Slice-Beam-Propagation-Methode (MSBP)62, die kürzlich vielversprechende Ergebnisse für die biologische Bildgebung gezeigt hat42,63. In unserer ersten Implementierung von MSBP verwenden wir genau denselben elektrischen Felddatensatz, den GPSC oben verwendet hat. Eine anfängliche Schätzung des 3D-RI der Probe wird ausgewählt, um das iterative Verfahren zu starten. Anschließend wird die MSBP-Methode verwendet, um Streumessungen zu simulieren, die sich aus ebenen Wellen ergeben, die sich durch den ursprünglich geschätzten 3D-RI der Probe ausbreiten. Die aus dieser Simulation resultierenden Streufelder werden mit denen verglichen, die experimentell mit unseren TPM-Systemen erhalten wurden. Der zwischen den simulierten und experimentellen Messungen berechnete Fehler wird durch jede Schicht der 3D-Probenschätzung zurückgepflanzt, um den RI-Wert jedes Voxels schrittweise zu ändern. Fortgesetzte Iterationen, bei denen diese Schritte wiederholt werden, führen schließlich dazu, dass die 3D-Stichprobenschätzung zu einer stabilen stationären Lösung konvergiert. Wir haben das MSBP mit elektrischen Feldmessungen (MSBP-E) über den Learning Tomography-Algorithmus (LT)42 implementiert. Das LT-Verfahren ist ein iterativer Optimierungsalgorithmus mit zusätzlicher schwacher Totalvariations-Regularisierung (TV), die in jeder Iteration angewendet wird, um Konvergenz sicherzustellen. Wir haben festgestellt, dass die Methode am besten funktioniert, wenn eine erste Vermutung als Ausgangspunkt für den iterativen Prozess gewählt wird. In diesem Artikel verwenden wir die Methode der direkten Inversion, um die erste Schätzung zu liefern.

Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass der Gradientenaktualisierungsschritt innerhalb der MSBP-Methode umformuliert werden kann, um 3D-RI nur aus nicht-interferometrischen Intensitätsmessungen zu rekonstruieren31. Zu den Hauptvorteilen dieser Methode gehört die Verwendung eines nicht-interferometrischen Bildgebungssystems, das resistent gegen mechanische Instabilitäten ist, die oft den Langzeiteinsatz von Doppelarm-Interferometern ohne Neuausrichtung einschränken. Darüber hinaus kann die Lichtquelle teilweise kohärent sein, um kohärente Speckle-Artefakte in den Messungen zu vermeiden und gleichzeitig die für die RI-Rekonstruktion erforderliche ausreichende Kohärenz beizubehalten. Um die 3D-RI-Rekonstruktion mit dieser reinen Intensitätsvariante von MSBP (die wir hier als MSBP-I bezeichnen) zu demonstrieren, verwenden wir einfach die Amplitudenkomponente der elektrischen Feldmessungen, die für die GPSC- und MSBP-E-Rekonstruktionen verwendet werden. oben beschrieben. Ähnlich wie bei MSBP-E wird bei jeder Iteration eine Totalvariations-Regularisierung angewendet. Der Ausgangspunkt für MSBP-I ist eine Matrix aus Nullen.

Bei allen beschriebenen TPM-Rekonstruktionsmethoden handelt es sich um iterative Verfahren, die das gleiche Stoppkriterium verwenden, um die Berechnungen automatisch zu beenden. Dieses Kriterium ist eine Modifikation einer zuvor vorgestellten Methode64 und wird in Alg. beschrieben. 1 unten. Die allgemeine Intuition hinter diesem Verfahren besteht darin, den iterativen Berechnungsprozess zu beenden, wenn die Dynamik der Änderung zwischen 3D-Stichprobenschätzungen, die aus aufeinanderfolgenden Iterationen ausgegeben werden, unter einen bestimmten Sättigungspegel \(\epsilon\) fällt. Um weniger abhängig von Ausreißern zu sein, wird der Medianwert der Dynamik aus den letzten 10 Iterationen berechnet. Der Wert für \(\epsilon\) wird für jeden Algorithmus empirisch ausgewählt. Für GPSC \(\epsilon =0,02\), für LT und MS \(\epsilon =0,01\). Die Werte von \(\epsilon\) wurden empirisch ausgewählt, um ein Gleichgewicht zwischen unvollständiger Konvergenz und Rekonstruktionsgeschwindigkeit herzustellen.

Die den in diesem Dokument präsentierten Ergebnissen zugrunde liegenden Daten sind im Datensatz 140 verfügbar.

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Die Autoren danken Prof. Maciej Szkulmowski von der Nikolaus-Kopernikus-Universität für den Zugang zu der in dieser Arbeit verwendeten Nahinfrarot-Lichtquelle. Die Autoren möchten Demetri Psaltis und Joowon Lim von der École Polytechnique Fédérale de Lausanne für die Bereitstellung des Codes für den Learning Tomography-Algorithmus danken.

Die Forschung, die zu den beschriebenen Ergebnissen führte, wurde im Rahmen des Programms TEAM TECH/2016-1/4 der Stiftung für polnische Wissenschaft durchgeführt, das von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung kofinanziert wurde. Die Entwicklung von Kalibrierungsobjekten wurde durch das FOTECH-1-Projekt finanziert, das von der Technischen Universität Warschau im Rahmen des Programms Exzellenzinitiative: Forschungsuniversität (ID-UB) gefördert wurde. Wir danken auch der University of Texas at Austin, der Cockrell School of Engineering und der Chan Zuckerberg Initiative für ihre Unterstützung.

Institut für Mikromechanik und Photonik, Technische Universität Warschau, Boboli-Straße 8, Warschau, 02-525, Polen

Wojciech Krauze, Arkadiusz Kuś, Michał Ziemcznok & Małgorzata Kujawińska

Fakultät für Elektrotechnik, University of Texas at Austin, 2501 Speedway, Austin, TX, 78712, USA

Max Haimowitz & Shwetadwip Chowdhury

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Kredit. WK: Konzeptualisierung, formale Analyse, Methodik, Software, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. AK: Konzeptualisierung, Finanzierungseinwerbung, Untersuchung, Methodik, Projektverwaltung, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. MZ: Datenkuration, Untersuchung, Methodik, Ressourcen, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. MH: Software, Schreiben – Rezensieren und Bearbeiten. SC: Finanzierungsbeschaffung, Software, Schreiben–Rezension und Bearbeitung. MK: Finanzierungseinwerbung, Projektverwaltung, Schreiben–Rezension und Bearbeitung.

Korrespondent ist Wojciech Krauze.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krauze, W., Kuś, A., Ziemczonok, M. et al. 3D-Streumikrophantomprobe zur Beurteilung der quantitativen Genauigkeit in tomographischen Phasenmikroskopietechniken. Sci Rep 12, 19586 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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Eingegangen: 31. August 2022

Angenommen: 11. November 2022

Veröffentlicht: 15. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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