Kontinuierlich skalierbar

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6857 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Virale Vektoren stellen einen Engpass bei der Herstellung zellulärer Therapien dar. Die Elektroporation hat sich als Ansatz für die nicht-virale Transfektion von Primärzellen herausgestellt, doch Standardansätze auf Küvettenbasis leiden unter geringem Durchsatz, schwieriger Optimierung und Inkompatibilität mit der Zellherstellung im großen Maßstab. Hier stellen wir eine neuartige Elektroporationsplattform vor, die eine schnelle und reproduzierbare Elektroporation ermöglicht und kleine Zellvolumina für Forschungs- und Prozessoptimierungen effizient transfizieren und auf die für Anwendungen in der Zelltherapie erforderlichen Volumina skalieren kann. Wir demonstrieren die Abgabe von Plasmid-DNA und mRNA an primäre menschliche T-Zellen mit hoher Effizienz und Lebensfähigkeit, wie z. B. > 95 % Transfektionseffizienz für die mRNA-Lieferung mit < 2 % Verlust der Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollzellen. Wir stellen Methoden zur Skalierung der Lieferung vor, die einen experimentellen Durchsatz von 256 Millionen Zellen/min erreichen. Schließlich demonstrieren wir eine therapeutisch relevante Modifikation primärer T-Zellen mithilfe von CRISPR/Cas9, um die Expression des T-Zell-Rezeptors (TCR) zu unterdrücken. Diese Studie zeigt die Fähigkeiten unseres Systems, ungedeckte Bedürfnisse nach effizienter, nicht-viraler Entwicklung von T-Zellen für die Zellherstellung zu erfüllen.

Zelltherapien haben wegen ihres Potenzials zur Behandlung einer Vielzahl vererbter und erworbener Krankheiten Begeisterung hervorgerufen. Insbesondere Immuntherapien, die autologe T-Zellen verwenden, die so modifiziert sind, dass sie chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben bei bestimmten hämatologischen Krebsarten bemerkenswerte vollständige Ansprechraten mit dauerhaften, langanhaltenden Remissionen erzielt. Die Forschung konzentriert sich auf die Behandlung anderer Krebsarten, beispielsweise solider Tumoren. Die erste Generation zugelassener CAR-T-Zelltherapien basiert jedoch auf viralen Vektoren wie dem Lentivirus oder dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) für die zelluläre Reprogrammierung1,2,3,4,5. Virale Vektoren haben eine hocheffiziente Transduktion schwer zu transfizierender primärer menschlicher Immunzellen ermöglicht, weisen jedoch mehrere Nachteile auf, die mit ihren komplexen und kostspieligen Herstellungsprozessen, ihrer Immunogenität und ihrem Potenzial für Insertionsmutagenese zusammenhängen6,7,8. Darüber hinaus tendiert der Bereich zu komplexeren Reprogrammierungsmethoden, wie z. B. mehreren Genbearbeitungen mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie und der Geninsertion durch Transposonelemente, die nicht mit den typischen Verpackungsgrenzen kompatibel sind, die mit viralen Ansätzen verbunden sind9,10,11,12,13.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, haben sich die Forschungsbemühungen zunehmend auf nicht-virale Transfektionsmethoden konzentriert, um die Virusabgabe zu ersetzen9,14,15. Unter den nicht-viralen Transfektionsmethoden ist die Elektroporation ein gut untersuchter Ansatz, der häufig zum Transport von DNA, RNA und Proteinen in Zellen verwendet wird und als führender Kandidat für den Ersatz viraler Vektoren gilt. Beispielsweise demonstrierten Bozza et al. die Fähigkeit, Elektroporation zur Erzeugung rekombinanter T-Zellen mithilfe nichtintegrierender DNA-Nanovektoren zu nutzen, die viele der mit viralen Ansätzen verbundenen Nachteile umgehen8. In ähnlicher Weise wurde die Elektroporation kürzlich zur Erzeugung von CAR-T-Zellen mithilfe des Sleeping Beauty-Transposonsystems für die erste klinische Studie mit virusfreien CAR-T-Zellen in Europa16 sowie mit dem piggyBac-System17 eingesetzt.

Bei der seit vielen Jahren verwendeten Standardmethode der statischen Elektroporation wird ein elektrisches Feld erzeugt, indem elektrische Hochspannungsimpulse an Zellsuspensionen in einer Küvette angelegt werden18. Die angelegten Hochspannungsimpulse erzeugen vorübergehende Poren in der Zellmembran, die es Molekülen ermöglichen, in die Zellen zu diffundieren19,20. Eine übermäßige elektrische Feldstärke kann jedoch zu einer irreversiblen Zerstörung der Zellmembran und zum Zelltod führen. Im Standardprozess gehören die Pulsspannung, die Anzahl der Pulse und die Pulsdauer zu den Parametern, die empirisch variiert werden, um die Effizienz der molekularen Insertion und das Zellüberleben zu optimieren. Die empirische Optimierung kann mühsam sein und es kann zu Schwankungen im Prozess kommen, unter anderem aufgrund der zufälligen Anordnung der Zellen in Bezug auf die Elektroden21. Darüber hinaus weisen standardmäßige Elektroporationsmethoden im Küvettenstil einen begrenzten Durchsatz auf, der mit der großtechnischen oder automatisierten Zellherstellung nicht kompatibel ist22. Einschränkungen hinsichtlich der Effizienz des molekularen Transfers, der Lebensfähigkeit der Zellen, der Prozessvariabilität und des begrenzten Durchsatzes haben daher die weit verbreitete Anwendung dieser Methode eingeschränkt, obwohl die potenziellen Vorteile gegenüber der Verwendung viraler Vektoren bekannt sind.

Hier beschreiben wir eine neuartige mikrofluidische Elektroporationsplattform, die eine schnelle und reproduzierbare Elektroporation ermöglicht und die Bereitstellung von der Forschung bis zum klinischen Maßstab für Anwendungen in der Zelltherapie nahtlos skalieren kann. Unser Ansatz umfasst eine planare Durchflusszelle mit einer dünnen Plattengeometrie, die sicherstellt, dass jede Zelle dem gleichen elektrischen Feld für eine reproduzierbare Elektroporation ausgesetzt ist. Insbesondere kann die Breite des Geräts in horizontaler Richtung senkrecht zur Strömung variiert werden, um sie an den gewünschten experimentellen Durchsatz anzupassen, ohne das elektrische Feld zu verändern, dem die Zellen ausgesetzt sind. Mit unserer Plattform demonstrieren wir die Abgabe von Plasmid-DNA und mRNA an primäre T-Zellen mit hoher Effizienz und minimaler Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Durch die Skalierung der Breite unseres Geräts und anderer Parameter wie der Flussrate zeigen wir, wie Transfektionsparameter, die mithilfe einer Multiplex-Optimierung in kleinen Volumina identifiziert wurden, problemlos in groß angelegte Transfektionen implementiert werden können, die für die Zellherstellung erforderlich sind. Schließlich nutzen wir unsere Plattform, um eine therapeutische Modifikation primärer T-Zellen durchzuführen: die Abgabe von CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexen, die gegen den T-Zell-Rezeptor (TCR) gerichtet sind. Unsere Daten zeigen das Potenzial unseres Systems, ungedeckte Anforderungen an die effiziente, nicht-virale Entwicklung von T-Zellen für die Zellherstellung zu erfüllen.

Unsere Plattform umfasst einen Einweg-Mikrofluidkanal mit kontinuierlichem Durchfluss, der eine effiziente und reproduzierbare Elektrotransfektion von Zellen ermöglicht. Der Mikrofluidikkanal besteht aus einem planaren Strömungschip mit dünner Plattengeometrie. Auf der oberen und unteren Strömungsoberfläche sind Elektroden angeordnet, um ein gleichmäßiges elektrisches Feld senkrecht zur Strömungsrichtung anzulegen (Abb. 1A). Das elektrische Feld wird mit einer kontinuierlich zyklischen, willkürlichen Spannungswellenform angelegt. Die geringe Kanalhöhe von 80 µm stellt sicher, dass jede Zelle dem gleichen elektrischen Feld und der gleichen chemischen Umgebung ausgesetzt ist, um eine reproduzierbare Elektroporation zu ermöglichen. Die geringe Kanalhöhe ermöglicht es uns auch, die erforderliche elektrische Feldstärke zum vorübergehenden Öffnen von Poren in der Plasmamembran zu erreichen, die typischerweise auf 10 bis 100 kV/m23 geschätzt wird, und zwar unter Verwendung relativ niedriger Spannungsamplituden (etwa 1–8 V) im Vergleich zur Hochspannung traditioneller kommerzieller Systeme. Beispielsweise führt eine angelegte Spannung von 10 V für unsere Kanalhöhe von 80 µm zu einer elektrischen Feldstärke von 125 kV/m. Diese relativ niedrigen Spannungsamplituden vermeiden in Kombination mit einem Elektroporationspuffer mit niedriger Leitfähigkeit, einem konstanten Flüssigkeitsfluss und einem kontinuierlichen Wechsel der Spannungswellenform Probleme mit hydrolysebedingter Blasenbildung innerhalb des Mikrofluidikkanals, die andernfalls die Elektroporation beeinträchtigen könnten. Die Breite (2 oder 10 mm) der in diesen Experimenten verwendeten Geräte ist viel größer als ihre Tiefe, um einen schnellen und kontinuierlichen Fluss der Zellen durch den Chip zu ermöglichen (Abb. 1B). Wichtig ist, dass die Breite des Geräts größer als 10 mm sein und variiert werden kann, um dem gewünschten experimentellen Durchsatz zu entsprechen, ohne das elektrische Feld zu verändern, dem die Zellen ausgesetzt sind. Daher ermöglicht unsere planare Geometrie die Bestimmung optimaler Transfektionsparameter mit kleinen Volumina und Kanalbreiten, bevor sie für die Bereitstellung im klinischen Maßstab auf große Volumina und Kanalbreiten skaliert werden.

Übersicht über die CyteQuest-Elektroporationsplattform. (A) Seitenansicht und (B) Draufsichtschema der Elektroporations-Durchflusszelle (nicht maßstabsgetreu). (C) Foto einer experimentellen Durchflusszelle mit angeschlossenen Verteilern, Schläuchen und drei Sätzen unabhängig adressierbarer Elektroden. (D) Blockdiagramm, das die Komponenten zeigt, aus denen die Elektroporationsplattform besteht. (E) Diagramm, das eine bipolare rechteckige Wellenform mit der Frequenz f, der Dauer t und der Spannungsamplitude V darstellt.

Unser Gerät ist für die Integration in automatisierte Zellverarbeitungsansätze unter Verwendung einer wählbaren, computergesteuerten Spannungswellenform und einer robotergestützten Fraktionssammlung konzipiert. Unsere Plattform ist in der Lage, jede beliebige elektrische Wellenform zu liefern. Während des typischen Betriebs werden Zellen durch eine Spritzenpumpe durch einen einzelnen Flüssigkeitseinlass in den Kanal getrieben und durch einen einzelnen Flüssigkeitsauslass wieder verlassen (Abb. 1C). Zellen werden typischerweise in einem Elektroporationspuffer mit niedriger Leitfähigkeit suspendiert, der die zu liefernde Ladung enthält. Um die Elektrotransfektion zu optimieren, steuert ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript einen Funktionsgenerator, der vorprogrammierte elektrische Wellenformen enthält, während ein Roboter-Autosampler so programmiert ist, dass er den Auslassschlauch für die Abgabe in einer Multiwell-Platte bewegt (Abb. 1D). Um die an die Zellen angelegte elektrische Wellenform schnell zu ändern, ist die Durchflusszelle mit einem minimalen Volumen (~ 11 µL) stromabwärts der Elektrodenpaare ausgelegt. Dieses stromabwärts gelegene Volumen wird zwischen dem Auslassschlauch (~ 6 µL) und dem Strömungskanal (~ 5 µL) aufgeteilt. Wenn also die vorprogrammierte elektrische Wellenform ausgetauscht wird, stellen die aus dem Auslassschlauch austretenden Zellen fast augenblicklich Zellen dar, die die neue Wellenform empfangen haben. Indem wir den Roboter-Autosampler so steuern, dass er während des Wellenformwechsels in die Vertiefung eintaucht, können wir einen hohen Reinheitsgrad in jeder Vertiefung gewährleisten. Der Zeitraum gemischter Probenbedingungen, der durch den Übergang der angelegten Spannungsbedingungen entsteht, wird durch die relativ lange Verweilzeit pro Vertiefung (10 s) verdünnt, die um den Faktor 5 größer ist als die Austauschgeschwindigkeit (~ 2 s). Daher kann unsere Plattform die elektrischen Parameter für die Transfektion schnell und einfach optimieren. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Verwendung bipolarer Rechteckwellenformen, die durch ihre Frequenz (f), Dauer (t) und Spannungsamplitude (V) beschrieben werden können (Abb. 1E). Insgesamt ermöglicht dieser Roboteraufbau ein schnelles Durchsuchen elektrischer Parameter, um die für die Transfektion gewünschten Bedingungen auszuwählen. Anschließend wird eine Transfektion in größerem Maßstab unter den ausgewählten elektrischen Bedingungen durchgeführt.

Während Wellenformen auf Zellen angewendet werden, steuert das benutzerdefinierte MATLAB-Skript auch ein Oszilloskop, um die Spannungswellenformen zu überwachen. Wir messen den Strom, indem wir die Spannung messen, die an einem 1-Ω-Widerstand in Reihe mit dem Flow-Chip abfällt. Repräsentative Diagramme der Spannung und des Stroms als Funktion der Zeit in einem 2 mm breiten Chip sind in Abb. 2 dargestellt. Einige reaktive Elemente sind vorhanden, da der Strom über das 100-µs-Intervall, über das die Spannung angelegt wird, leicht abnimmt. Der durchschnittliche Strom beträgt bei einer 23-V-Spannung ca. 7 mA. Wir berechnen das elektrische Feld \(\overrightarrow{E}\) innerhalb des Bereichs zwischen den Elektroden unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes \(\overrightarrow{J}=\sigma \overrightarrow{E}\), wobei \(\overrightarrow{ J}\) ist der Strom pro Flächeneinheit (der Elektrode) und \(\sigma\) ist die Leitfähigkeit des Puffers. Mit dem Messwert der Leitfähigkeit (9 × 10–3 S/m) und den Elektrodenabmessungen ergibt sich ein elektrisches Feld von ca. 278 kV/m. Dies stimmt gut mit einer einfachen Schätzung überein, die davon ausgeht, dass die Elektroden eine parallele Platte darstellen, die durch einen Leiter getrennt ist. In diesem Fall ist die elektrische Feldstärke die angelegte Spannung geteilt durch die Kanalhöhe von 80 Mikrometern. Bei dieser Schätzung werden kapazitive Effekte aufgrund von Ionen, die sich an der Elektrodenoberfläche ansammeln, außer Acht gelassen. Bei einer angelegten Spannung von 23 V ergibt dieses Modell jedoch eine Schätzung des elektrischen Feldes von 288 kV/m.

Zeitlich gemittelte Oszilloskop-Kurven, die die vom Oszilloskop gemessenen zeitlich veränderlichen Spannungen und Ströme anzeigen. (A) Mehrere Zyklen des Spannungskanals einer bipolaren Rechteckwellenform mit f = 66 Hz, V = 23 V und t = 100 µs. Das gepunktete Kästchen zeigt einen vergrößerten Zeitbereich der Wellenform mit der entsprechenden (B) Spannung über dem Kanal und (C) Strom durch den Kanal. Zeitliche Mittelung: 64 Spuren.

Um die Fähigkeit unserer Plattform zur Bereitstellung von mRNA zu demonstrieren, haben wir Jurkat- und primäre T-Zellen mit mRNA transfiziert, die für GFP kodiert. Primäre T-Zellen von gesunden Spendern wurden 4 Tage nach der Aktivierung mit CD3/CD28-Antikörpern transfiziert. Beide Zelltypen wurden in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml in Elektroporationspuffer mit niedriger Leitfähigkeit, der entweder 20 µg/ml oder 40 µg/ml GFP-kodierende mRNA enthielt, resuspendiert, in eine Spritze geladen und in unsere Elektroporations-Durchflusszelle geflossen in unseren Methoden beschrieben. Beim Durchgang der Zellen unter der Elektrode wurde die Wellenformfrequenz so gewählt, dass die Zellen während ihrer Transitzeit durch das elektrische Feld (t = 100 µs, f = 100 Hz) im Durchschnitt drei bipolare Rechteckwellenformen (Abb. 1E) empfingen. Dieser Wert wurde aus der durchschnittlichen Lineargeschwindigkeit, der Volumenströmungsrate und der Abmessung der Elektrode entlang der Strömungsrichtung abgeleitet. Als Kontrolle wurden Zellen bei einer angelegten Spannung von Null gesammelt.

Um die Abgabeleistung zu messen, wurden die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abb. 3A, B). Für jede Spannungsbedingung wurden Zellzahl, Lebensfähigkeit und GFP-Expression direkt durch sukzessives Gating gemessen, wie in den Methoden beschrieben. Die Lebensfähigkeit für jede Spannungsbedingung wurde berechnet als Anzahl lebensfähiger Zellen (Nviable), gemessen unter Verwendung eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs (7-AAD), dividiert durch die Anzahl der Gesamtzellen in dieser Spannungsbedingung, gemessen 24 Stunden nach der Transfektion (Ntotal). .

Lieferung von mRNA, die GFP kodiert, an Jurkat- und primäre T-Zellen. (A) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von Nullspannungskontrolle oder (B) elektroporierten Jurkat-Zellen, die Zellmorphologie, Lebensfähigkeit und GFP-Expression darstellen. (C) Einfluss unterschiedlicher Wellenformspannungsamplitude auf die Lieferung mit 20 oder 40 µg/ml mRNA an Jurkat-Zellen (n = 3). (D) Hocheffiziente Lieferung mit 40 µg/ml mRNA für primäre T-Zellen von vier gesunden Spendern (n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (C, D) angezeigt. Einige Fehlerbalken sind zu klein, um sichtbar zu sein (C).

Für primäre T-Zellen wurde ein Lebensfähigkeitsverhältnis berechnet, da die anfängliche Lebensfähigkeit jedes T-Zellspenders unabhängig von der Elektroporation zwischen 83 und 92 % lag. Das Lebensfähigkeitsverhältnis wurde als Lebensfähigkeit (Gleichung 1) dividiert durch die Lebensfähigkeit der Nullspannungskontrollzellen (Lebensfähigkeitsnullspannungskontrolle) berechnet.

Die Lebensfähigkeit von Nullspannungs-Kontrollzellen wird 24 Stunden nach der Transfektion anhand von Zellen gemessen, die ohne angelegtes elektrisches Feld durch das Gerät geflossen sind. Die GFP-Expression wurde als die Anzahl lebensfähiger und exprimierender Zellen (Nexpressing) geteilt durch die Anzahl lebensfähiger Zellen definiert.

Da unsere Messung der Lebensfähigkeit Zellen nicht berücksichtigt, die während der Elektroporation verloren gegangen sind (d. h. vollständige Lyse), haben wir auch die relative Ausbeute als Gesamtzahl der Zellen in jedem Spannungszustand (Ntotal) dividiert durch die Zahl der Nullspannungs-Kontrollzellen berechnet (Nullspannungsregelung).

Da der relative Ertrag anhand der Zellzahlen 24 Stunden nach der Transfektion gemessen wird, wird diese Messung durch Schwankungen bei der Zellaussaat, Schwankungen in der Proliferationsrate und Zelllyse oder -verlust während der Elektroporation beeinflusst.

Wir testeten die Abgabe von mRNA an Jurkat-Zellen mit entweder 20 oder 40 µg/ml mRNA, die für GFP kodiert, und einer Wellenformspannungsamplitude im Bereich von 3 bis 11 V (Abb. 3C). Als die Spannungsamplitude der Wellenform zunahm, beobachteten wir einen Schwellenwerteffekt, bei dem die GFP-Expression unter 5 V fehlte und dann anstieg, bis ein Plateauwert von ~ 97 % bei 11 V erreicht wurde. Bei allen getesteten Spannungsamplituden und mRNA-Konzentrationen blieb die Lebensfähigkeit relativ unverändert zu Nullspannungssteuerungen, während die relative Ausbeute > 90 % blieb (Abb. 3C, Abbildung S1A). Bemerkenswerterweise beobachteten wir eine GFP-Expression von 95 % ± 1,8 % in primären T-Zellen, die von vier gesunden Spendern stammten, während das Lebensfähigkeitsverhältnis und die relative Ausbeute 98 % ± 1,4 % bzw. 92 % ± 6,6 % betrugen (Abb. 3D, Abbildung S1B). . Repräsentative mikroskopische Bilder von primären T-Zellen, die mRNA exprimieren, die für GFP kodiert, sind in Abbildung S2 dargestellt. Somit belegen diese Daten die Fähigkeit unserer Plattform, mRNA mit hoher Effizienz bereitzustellen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.

Als Vergleich zu unserem Mikrofluidiksystem transfizierten wir primäre T-Zellen mit mRNA, die GFP kodiert (40 µg/ml), mithilfe eines küvettenbasierten Elektroporationssystems, dem Gene Pulser von Bio-Rad. Primäre T-Zellen wurden ähnlich wie in unserem System kultiviert und vorbereitet, mit der Ausnahme, dass die Zellen in Gene Pulser-Elektroporationspuffer und nicht in Puffer mit niedriger Leitfähigkeit suspendiert wurden. Wir beobachteten eine GFP-Expression von 83 ± 9 % mit einem Lebensfähigkeitsverhältnis von 91 ± 10 % (ergänzende Abbildung S3). Diese ähneln den von Bio-Rad gemeldeten Werten, die eine maximale GFP-Expression von 81 % und eine Lebensfähigkeit von 91 % aus primären T-Zellen melden, die mit demselben mRNA-Konstrukt transfiziert wurden (1). Angesichts der Tatsache, dass unsere Plattform sowohl für die GFP-Expression als auch für die Lebensfähigkeit höhere Werte liefert, zeigen diese Ergebnisse, wie unsere Plattform das Gene Pulser-Küvettensystem für die mRNA-Verabreichung übertrifft.

Angesichts der Tatsache, dass aktuelle autologe Zelltherapien große Mengen an manipulierten Zellen erfordern24, haben wir drei mit unserer Plattform leicht verfügbare Methoden untersucht, um den Zellverarbeitungsdurchsatz zu erhöhen: (1) proportionale Vergrößerung der Breite und Volumenstromrate des Flusskanals, (2) proportionale Erhöhung des Flüssigkeitsflusses Rate und Wellenformfrequenz und (3) Erhöhung der Zellkonzentration im Elektroporationspuffer.

Durch Erhöhen des Volumenstroms und der Kanalbreite um den gleichen Faktor bleibt die durchschnittliche lineare Strömungsgeschwindigkeit der Zellen unter der Elektrode unverändert und hat somit keinen Einfluss auf die elektrische oder chemische Umgebung der Zellen. Wir haben die Breite des Kanals von 2 mm, die in unserer Optimierungsstudie verwendet wurde, auf 10 mm erhöht und gleichzeitig die Volumenflussrate proportional von 320 µL/min auf 1,6 ml/min erhöht (Abb. 4A,B). Jurkat-Zellen wurden mit mRNA, die GFP kodiert (20 µg/ml), in beiden Kanälen unter Verwendung einer bipolaren Rechteckwellenform (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 13 V) bei einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml wie beschrieben elektroporiert vorher. Bemerkenswerterweise waren GFP-Expression, Lebensfähigkeit und relative Ausbeute im 2- und 10-mm-Kanal ungefähr identisch, während der Zellverarbeitungsdurchsatz um den Faktor fünf von 1,6 × 106 auf 8 × 106 Zellen/min stieg (Abb. 4C, Abbildung S4A). ). Diese Ergebnisse zeigen, dass die proportionale Erhöhung der Kanalbreite und der Volumenstromrate der Durchflusszelle eine einfache Methode zur nahtlosen Steigerung des Zellverarbeitungsdurchsatzes darstellt.

Steigerung des Zellverarbeitungsdurchsatzes für Volumina im klinischen Maßstab. (A) Foto einer 2 mm und (B) 10 mm Elektroporationsdurchflusszelle. Rote Pfeile markieren die Kanalbreite. (C) Diagramm der GFP-Expression und Lebensfähigkeitswerte von Jurkat-Zellen, die mit mRNA transfiziert wurden, die GFP in den 2- oder 10-mm-Kanälen kodiert (n = 3). (D) Diagramm der GFP-Expression und Lebensfähigkeitswerte von Jurkat-Zellen, die mit mRNA transfiziert wurden, die GFP im 2-mm-Kanal bei unterschiedlichen Zellkonzentrationen im Elektroporationspuffer (n = 3) kodiert. (E) Diagramm der GFP-Expression und Lebensfähigkeitswerte von Jurkat-Zellen, die mit mRNA transfiziert wurden, die GFP im 10-mm-Kanal bei unterschiedlichen Flussraten und Wellenformfrequenzen (n = 3) kodiert. (F) Diagramm der GFP-Expression und Lebensfähigkeit im Zeitverlauf aus einem Experiment, bei dem ~ 240 Millionen Zellen über 56 s transfiziert wurden (n = 1). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (C–E) angezeigt. Einige Fehlerbalken sind zu klein, um sichtbar zu sein (C–E).

Wir haben die Erhöhung der Zellkonzentration im Elektroporationspuffer als Methode zur Steigerung des Zellverarbeitungsdurchsatzes getestet. Jurkat-Zellen wurden mit mRNA, die GFP kodiert (20 µg/ml), unter Verwendung einer bipolaren Rechteckwellenform (t = 100 µs, V = 13 V, f = 100 Hz) wie zuvor beschrieben elektroporiert. Wir testeten transfizierende Zellen in einer Konzentration von 5, 10 oder 20 × 106 Zellen/ml und beobachteten keine Unterschiede in der GFP-Expression, Lebensfähigkeit oder relativen Ausbeute (Abb. 4D, Abbildung S4B). Daher bietet die Erhöhung der Zellkonzentration während der Transfektion eine weitere einfache Methode zur Steigerung des Zellverarbeitungsdurchsatzes.

Zusätzlich zur Erhöhung der Kanalbreite oder Zellkonzentration haben wir auch proportional die Volumenstromrate und die Frequenz der elektrischen Wellenform erhöht, um den Durchsatz zu erhöhen. Jurkat-Zellen wurden mit mRNA, die für GFP kodiert (20 µg/ml), unter Verwendung einer bipolaren Rechteckwellenform (t = 100 µs, V = 13 V) bei einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml wie zuvor beschrieben elektroporiert. Wir haben die Erhöhung der Wellenformfrequenz von 100 auf 800 Hz mit einem proportionalen Anstieg der Volumenflussrate von 1,6 auf 12,8 ml/min getestet. Wir beobachteten keine Unterschiede in der GFP-Expression, Lebensfähigkeit oder relativen Ausbeute (Abb. 4E, Abbildung S4C). Wichtig ist, dass durch die proportionale Erhöhung der Wellenformfrequenz und der Flussrate der Zelldurchsatz von 8 × 106 auf 64 × 106 Zellen/min gesteigert wurde. Daher kann diese Methode den Zellverarbeitungsdurchsatz erheblich steigern, ohne die Geometrie des Strömungskanals zu ändern.

Schließlich haben wir alle oben genannten Methoden zur Erhöhung des Zellverarbeitungsdurchsatzes in einem einzigen Experiment kombiniert, um in einer Demonstration einer Transfektion im klinischen Maßstab effizient mRNA-kodierendes GFP an etwa 240 Millionen Jurkat-Zellen zu liefern. Jurkat-Zellen wurden mit mRNA (20 µg/ml) unter Verwendung einer bipolaren Rechteckwellenform (t = 100 µs, V = 13 V, f = 800 Hz) bei einer Konzentration von 20 × 106 Zellen/ml bei einem Durchfluss von 12,8 ml/min transfiziert . Bei einer Verarbeitungsgeschwindigkeit von 256 Millionen Zellen/Minute dauerte die Lieferung an 240 Millionen Zellen etwa 56 Sekunden. Wir haben zu verschiedenen Zeitpunkten während der Abgabe Zellenproben entnommen und festgestellt, dass die GFP-Expression und die Lebensfähigkeit über die Zeit konstant bei 97 ± 0,12 % bzw. 96 ± 0,39 % waren (Abb. 4F). Der relative Ertrag schwankte stärker und lag bei 73 % ± 5 %. Insgesamt ermöglicht die Vielfalt der auf unserer Plattform verfügbaren Methoden zur Steigerung des Zellverarbeitungsdurchsatzes eine hocheffiziente Bereitstellung mit den für die Bereitstellung im klinischen Maßstab erforderlichen Geschwindigkeiten.

Um die Abgabe von Plasmid-DNA zu demonstrieren, verwendeten wir bipolare rechteckige Wellenformen mit einer festen Dauer (t = 100 µs) und testeten die Auswirkung der Variation von drei Parametern sowohl mit Jurkat- als auch mit primären Pan-T-Zellen: Wellenform-Spannungsamplitude (V), Wellenformfrequenz (f ) und Plasmidkonzentration.

Jurkat- und primäre Pan-T-Zellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Sowohl bei Jurkat- als auch bei primären T-Zellen führte die Erhöhung der Konzentration der GFP-kodierenden Plasmid-DNA zu einer erhöhten GFP-Expression, einer verringerten Lebensfähigkeit und einer verringerten relativen Ausbeute (Abb. 5A, C, Abbildung S5A, B). Repräsentative mikroskopische Bilder von primären T-Zellen, die Plasmid-DNA exprimieren, die für GFP kodiert, sind in Abbildung S6 dargestellt. Interessanterweise hatte eine Erhöhung der Plasmidkonzentration mit zunehmender Plasmidkonzentration geringere Erträge und geringere Zuwächse bei der GFP-Expression. In ähnlicher Weise erhöhte die Erhöhung der Wellenformfrequenz auch die GFP-Expression mit deutlich abnehmenden Erträgen bei gleichzeitiger Verringerung der Lebensfähigkeit und des relativen Ertrags (Abb. 5B, D, Abbildung S5C, D). Wir haben drei Wellenformfrequenzwerte getestet, die Zellen entsprechen, die durchschnittlich 1 (33 Hz), 2 (66 Hz) oder 3 (100 Hz) Wellenformen pro Durchgangszeit unter der Elektrode empfangen. Der Volumenstrom wurde in allen Fällen konstant gehalten. Im Allgemeinen gab es einen starken Anstieg der GFP-Expression von 33 auf 66 Hz, wobei es von 66 auf 100 Hz fast keinen weiteren Anstieg gab. Jurkat-Zellen zeigten in drei unabhängigen Experimenten eine reproduzierbare Leistung mit Standardabweichungswerten im Bereich von 1 bis 4 % für die GFP-Expression und 1 bis 5 % für die Lebensfähigkeit. Primäre T-Zellen zeigten eine signifikante Variation von Spender zu Spender (Abbildungen S7, S8). Insgesamt konnten wir durch Variation von drei Parametern die Plasmidexpression und die Lebensfähigkeit innerhalb eines breiten Wertebereichs für beide Zelltypen anpassen.

Ergebnisse für verschiedene Transfektionsparameter für die Abgabe von GFP-kodierender Plasmid-DNA an Jurkat- und primäre T-Zellen. (A) Einfluss variierender Plasmidkonzentration oder (B) Wellenformfrequenz für die Abgabe von Plasmid-DNA an Jurkat-Zellen. (C) Einfluss variierender Plasmidkonzentration oder (D) Wellenformfrequenz für die Abgabe von Plasmid-DNA an primäre T-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. n = 3 (A,B). Daten werden als Werte eines repräsentativen Spenders angezeigt; n = 1 (C,D). Einige Fehlerbalken sind zu klein, um für Jurkat-Zellen (A, B) sichtbar zu sein.

Als Vergleich zu unserem Mikrofluidiksystem transfizierten wir primäre T-Zellen mit Plasmid-DNA, die GFP kodiert (75 µg/ml), unter Verwendung des Gene Pulser-Küvettensystems. Primäre T-Zellen, die im Gene Pulser mit Plasmid-DNA transfiziert wurden, zeigten eine GFP-Expression von 62 ± 15 % und ein Lebensfähigkeitsverhältnis von 70 ± 19 % (ergänzende Abbildung S3). In unserem System berichten wir für die ähnlichsten Lieferbedingungen über eine GFP-Expression von 65 ± 7 % und ein Lebensfähigkeitsverhältnis von 70 ± 9 % (f = 33 Hz, V = 29 V, t = 100 µs). Ähnliche Mittelwerte für die GFP-Expression und das Lebensfähigkeitsverhältnis lassen auf eine ähnliche Leistung bei der Abgabe von Plasmid-DNA schließen. Allerdings liefert unsere Mikrofluidik-Plattform niedrigere Werte für die Standardabweichung, was wahrscheinlich auf das gleichmäßige elektrische Feld zurückzuführen ist, das der dünnen Plattengeometrie unseres Flow-Chips innewohnt. Niedrigere Standardabweichungswerte für die GFP-Expression und -Lebensfähigkeit bieten einen deutlichen Vorteil unserer Mikrofluidik-Plattform.

Um die Flexibilität unserer Plattform zu demonstrieren, haben wir Plasmid-DNA, die GFP kodiert, mithilfe einer willkürlichen Wellenform an Jurkat-Zellen abgegeben. Wir haben eine zweistufige Wellenform ausgewählt, die durch ein kurzes Segment mit hoher Amplitude (V1, t1) gekennzeichnet ist, von dem angenommen wird, dass es Poren keimt, gefolgt von einem längeren Segment mit niedriger Amplitude (V2, t2), von dem angenommen wird, dass es die Poren wachsen lässt und elektrophoretisch antreibt geladene Ladung, wie z. B. DNA, in die Zelle25,26 (Abb. 6A). Einige Gruppen haben herausgefunden, dass Wellenformen auf zwei Ebenen die Plasmid-DNA-Expression positiv mit der Lebensfähigkeit der Zellen in Einklang bringen. Motiviert durch diese Berichte und als Demonstration der Leistungsfähigkeit unseres Systems wählten wir f = 66 Hz, V1 = 21 V und t1 = 75 µs und maßen die Auswirkung unterschiedlicher V2 oder t2 des Segments mit längerer Dauer und niedriger Amplitude (Abb. 6A).

Lieferung einer beliebigen elektrischen Wellenform. (A) Diagramm, das eine bipolare, duale Spannungswellenform darstellt, die durch ein kurzes Segment mit hoher Amplitude (V1, t1) gekennzeichnet ist, gefolgt von einem langen Segment mit niedriger Amplitude (V2, t2). (B) Auswirkung von variierendem V2 während t2 = 250 µs (n = 3). (C) Auswirkungen der Variation von t2 bei V2 = 4 V (n = 3). Sowohl in (B) als auch (C) legen wir f = 66 Hz, V1 = 21 V und t1 = 75 µs fest. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (B, C) angezeigt. Einige Fehlerbalken sind zu klein, um sichtbar zu sein (B,C).

Jurkat-Zellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Die Effizienz der Transfektion wurde als Produkt aus GFP-Expression und Lebensfähigkeit definiert und als einzelne Metrik berechnet, um die Wellenformleistung zu vergleichen. Als entweder V2 oder t2 zunahmen, nahm die GFP-Expression zu, während die Lebensfähigkeit und der relative Ertrag abnahmen (Abb. 6B, C, Abbildung S9). Bemerkenswert ist, dass unsere Metrik für Wellenformleistung und Effizienz einen Spitzenwert bei Zwischenwerten von V2 aufwies, was zeigt, wie eine Wellenform mit zwei Spannungspegeln GFP-Expression und Lebensfähigkeit günstig ausgleichen kann. Insgesamt zeigen diese Daten die Fähigkeiten unserer Plattform, eine beliebige Spannungswellenform zu liefern, und wie diese Fähigkeit Vorteile für die Verbesserung der Elektroporationsleistung von Plasmid-DNA bieten könnte.

Um unsere Fähigkeit zu demonstrieren, Fracht über GFP hinaus zu liefern, haben wir uns als nächstes dem CRISPR-Cas9-System zugewandt. Wir haben uns dafür entschieden, auf die TRAC- und TRBC-Loci abzuzielen, die für TCR-Alpha- und -Beta-Ketten kodieren, da das Ausschalten der TCR-Expression als Methode zur Vermeidung der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD) für die Entwicklung allogener CAR-T-Zellen untersucht wird14. Primäre T-Zellen von gesunden Spendern wurden 4 Tage nach der Aktivierung mit CD3/CD28-Antikörpern unter Verwendung bipolarer Rechteckwellenformen (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 5–29 V) und unter Verwendung von CRISPR-Cas9-RNPs (1 µM) transfiziert. . Die TCR-Expression, das Lebensfähigkeitsverhältnis und die relative Ausbeute wurden 72 Stunden nach der Transfektion mithilfe von Anti-Human-TCR-Antikörpern und Durchflusszytometrie gemessen. Mit zunehmender Spannungsamplitude der Wellenform sank die TCR-Expression steil von 89 ± 1,0 % auf 7,4 ± 1,0 % (Abb. 7). Das Lebensfähigkeitsverhältnis verringerte sich ebenfalls mit zunehmender Spannung mit minimalen Änderungen bis zu 25 V, was zu einer TCR-Expression von 12 ± 2,1 % und einem Lebensfähigkeitsverhältnis von 88 ± 1,0 % führte. Nach 25 V fiel das Lebensfähigkeitsverhältnis stark ab. Als nächstes haben wir die Proliferationskapazität von Kontrollzellen (0 V) und elektroporierten Zellen (25 V und 29 V) über einen Zeitraum von 7 Tagen nach der Transfektion gemessen (Abbildung S10). Nullspannungs-Kontroll-T-Zellen expandierten schnell und erlebten während des 7-tägigen Beobachtungszeitraums mehrere Populationsverdoppelungen. Mit der 25-V-Wellenform elektroporierte T-Zellen zeigten 2 Tage nach der Elektroporation im Vergleich zu Kontrollzellen eine geringere Proliferationsrate. Nach dieser Erholungsphase vermehrten sich Zellen, die die 25-V-Wellenform empfingen, mit der gleichen Geschwindigkeit wie Kontrollzellen. T-Zellen, die eine höhere Wellenformamplitude empfingen, zeigten eine geringere Proliferationskapazität. Diese Ergebnisse veranschaulichen den Kompromiss zwischen sehr hohen Transfektionseffizienzen und der Zellgesundheit. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass unsere Plattform in der Lage ist, CRISPR/Cas9-Gentechnik durchzuführen, was eine vielversprechende Technik zur Weiterentwicklung von Zelltherapien über die derzeit zugelassenen autologen Zelltherapien hinaus darstellt.

Lieferung von CRISPR/Cas9-RNPs, die auf TRAC/TRBC abzielen. Diagramm der TCR-Expression, des Lebensfähigkeitsverhältnisses oder des relativen Ertrags als Funktion der angelegten Spannungsamplitude, gemessen 72 Stunden nach der Transfektion primärer T-Zellen mit CRISPR/Cas9-RNPs, die auf TRAC/TRBC abzielen (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einige Fehlerbalken sind zu klein, um sichtbar zu sein.

Die Elektroporation stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um virusbasierte Methoden zur Herstellung von Zelltherapien zu ersetzen. Traditionelle Methoden im Küvettenstil bleiben jedoch durch Prozessvariabilität, schwierige Optimierung und geringen Durchsatz begrenzt. Hier präsentieren wir eine neuartige Elektroporationsplattform, die diese Einschränkungen durch den Einbau einer planaren Durchflusszelle in Verbindung mit automatisierten Experimenten umgeht. Wie unsere Leistungsdaten zeigen, können wir schnell einen großen Parameterraum erkunden, um Bedingungen für die effiziente Lieferung verschiedener molekularer Ladungen an Zellen abzuleiten. Wichtig ist auch, dass wir gezeigt haben, wie Optimierungen, die mit kleinen Volumina durchgeführt wurden, direkt in groß angelegte Transfektionen für die Zellherstellung umgesetzt werden können. Zusammengenommen zeigen diese Innovationen das Potenzial unserer Plattform, ungedeckten Bedarf an nicht-viraler Technik von T-Zellen für die Zellherstellung zu decken.

Wir beobachteten eine hocheffiziente Abgabe von für GFP kodierender mRNA an Jurkat- und primäre T-Zellen (> 98 % für Jurkat, > 95 % primäre T-Zellen), ohne die Lebensfähigkeit der Zellen oder die relative Ausbeute unseres Geräts wesentlich zu beeinträchtigen. Unsere mRNA-Abgabeleistung übertrifft die von Elektroporationsgeräten im Küvettenstil gemeldeten Werte und erfüllt oder übertrifft die Leistungskennzahlen anderer mikrofluidischer, nicht-viraler Transfektionsansätze27,28,29,30. Für unsere Vergleiche mit anderen Ansätzen, einschließlich unserer Transfektionen mit dem Gene Pulser-System, ist es wichtig zu beachten, dass experimentelle Bedingungen die Transfektionsleistung erheblich verändern können, einschließlich Zellvorbereitung, Zell- und/oder Ladungskonzentrationen und Wahl des Elektroporationspuffers31,32,33. Wichtig ist, dass wir die mRNA-Abgabe nahtlos skalieren konnten, indem wir die Konzentration der Zellen im Elektroporationspuffer, die Breite des Kanals, die Flussrate und die Wellenformfrequenz erhöhten. Die Kombination dieser Skalierungsmethoden ermöglichte es uns, den Durchsatz bei einer Kanalbreite von 10 mm auf bis zu 256 Millionen Zellen/min zu steigern, eine Breite, die noch erweitert werden kann. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass wir durch die Vergrößerung der Breite unseres Kanals und die Verwendung nachgewiesener Fluss-, chemischer und elektrischer Bedingungen die erforderlichen Zellmengen für Zelltherapien erreichen können, für die häufig mehr als 1 Milliarde Zellen erforderlich sind14,34,35.

Aktuelle autologe T-Zelltherapien erfordern eine lange und kostspielige Herstellung, was ihren klinischen Einsatz in großem Maßstab einschränkt14. Universelle „Standard“- oder allogene CAR-T-Zellen von gesunden Spendern könnten diese Einschränkungen umgehen, aber allogene CAR-T-Zellen könnten vom Immunsystem des Wirts schnell eliminiert werden und auch eine lebensbedrohliche Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit verursachen ( GVHD)35,36. Die Störung der Gene, die für TCR-α (TRAC) und TCR-β (TRBC) kodieren, wurde an anderer Stelle als Methode zur Verringerung des GVHD-Risikos beschrieben und wird derzeit in präklinischen Studien und klinischen Studien untersucht36,37,38,39. Hier demonstrieren wir die Bereitstellung von CRISPR-Cas9-RNPs, um die primäre T-Zell-Expression von TCR effizient auszuschalten, um zu zeigen, wie unser Gerät für die Herstellung allogener CAR-T-Zellen der nächsten Generation verwendet werden könnte.

Die dünne Plattengeometrie und die parallelen Plattenelektroden unserer Durchflusszelle sind die Innovation, die viele der Stärken unserer Plattform bietet, darunter (1) die Fähigkeit, jede Zelle dem gleichen elektrischen Feld auszusetzen und (2) die Möglichkeit, sie auf jeden gewünschten Durchsatz zu skalieren minimaler Aufwand. Diese Innovationen unterscheiden unseren Ansatz von anderen Ansätzen zur Entwicklung mikrofluidischer, nicht-viraler Transfektionsgeräte. Die geringe Kanalhöhe (80 µm) erzeugt eine parallele Plattengeometrie mit einem räumlich gleichmäßigen elektrischen Feld, das eine hoch reproduzierbare Elektroporation ermöglicht. Wir melden Standardabweichungen für die GFP-Expression und -Lebensfähigkeit routinemäßig unter 5 %. Darüber hinaus ermöglicht uns die geringe Kanalhöhe, die erforderliche elektrische Feldstärke, typischerweise etwa 10–100 kV/m, für die Elektroporation mit relativ geringer Spannungsamplitude (etwa 1–8 V) im Vergleich zu herkömmlichen kommerziellen Systemen oder einigen anderen mikrofluidischen Elektroporationsgeräten zu erreichen28. Wir haben beispielsweise beobachtet, dass die mRNA-Expression bei einer Spannungsamplitude von 5 V begann und bei etwa 11 V ein Plateau erreichte. Daher kann unser Gerät die Verwendung hoher Spannungen vermeiden. Unser Gerät verfügt außerdem über ein einfaches Einzelströmungssystem, das im Gegensatz zu komplexeren Ansätzen wie dem von Lissandrello et al.28 verwendeten Mehrströmungssystem steht.

Die planare Architektur des Flusschips, bei der das Verhältnis der schmalen zur breiten Abmessung senkrecht zur Strömung weniger als 10 % beträgt, spielt eine wichtige Rolle bei der Fähigkeit, die Breite und Flussrate zu erhöhen, ohne die elektrische Umgebung der Zellen zu beeinträchtigen. In einem mikrofluidischen Gerät mit kreisförmigem Querschnitt oder einem Gerät, bei dem das Verhältnis von Breite zu Höhe etwa 1 beträgt, hat die Fluidgeschwindigkeit über den Kanal hinweg eine parabolische Form mit einem Maximum in der Mitte. Wie in Brody et al. diskutiert, wird das Geschwindigkeitsprofil in einem rechteckigen Kanal entlang der breiten Dimension „pfropfenförmig“, wenn das Verhältnis der schmalen zur breiten Dimension weniger als 10 % beträgt40. Dieses pfropfenförmige Profil ist konstant, bis es an den Rändern über eine Distanz, die mit der Höhe des Kanals vergleichbar ist, auf die Geschwindigkeit Null übergeht. Dieses pfropfenförmige Geschwindigkeitsprofil ist ein bekanntes Merkmal der sogenannten Hele-Shaw-Strömung in rechteckigen Durchflusszellen mit einem kleinen schmalen zu breiten Seitenverhältnis. Dies impliziert, dass die Zeit, die eine Zelle in der von uns beschriebenen Durchflusszelle einem elektrischen Feld ausgesetzt ist, für jede Position entlang der Breite der Durchflusszelle im Wesentlichen konstant ist (außer in der Nähe der Kanten, wie beschrieben). Wenn wir den Durchsatz des Geräts durch proportionale Vergrößerung der Breite und des Volumenstroms erhöhen, bleibt diese Eigenschaft gültig. Das Strömungsgeschwindigkeitsprofil in vertikaler Richtung ist parabolisch. Da die Größe der Zellen jedoch einen nicht vernachlässigbaren Bruchteil der Kanalhöhe ausmacht, ist die Streuung der Strömungsgeschwindigkeit in vertikaler Richtung geringer als die Streuung kleiner Partikel. Wichtig ist, dass das parabolische Profil der Strömungsgeschwindigkeit in vertikaler Richtung keinen Einfluss auf unsere Fähigkeit hat, den Durchsatz durch proportionale Erhöhung der Breite und der Volumenströmungsrate aufgrund der zuvor erwähnten Hele-Shaw-Strömung in der breiten Dimension zu skalieren. Somit bleiben die in einem Gerät mit geringer Probenmenge optimierten Elektroporationsparameter in einem solchen Gerät mit erhöhter Breite und Durchflussrate unverändert.

Hier haben wir unsere Skalierungsfunktion demonstriert, indem wir die Transfektionsleistung zwischen zwei verschiedenen Flusszellen mit unterschiedlichen Kanalbreiten verglichen haben: einem 2-mm-Kanal und einem 10-mm-Kanal. Durch die Vergrößerung der Kanalbreite und der Durchflussrate um den Faktor fünf wurde der Versuchsdurchsatz bei identischer Leistung und identischer elektrischer Wellenform um den Faktor fünf erhöht. Diese Fähigkeit, Transfektionsparameter mithilfe kleiner Zell- und Reagenzienvolumina zu bestimmen und optimierte Parameter direkt für die Bereitstellung großer Volumina im klinischen Maßstab zu übertragen, ist ein wesentlicher Vorteil unserer Plattform. Obwohl es mehrere andere Plattformen mit kontinuierlichem Durchfluss gibt, die zur nicht-viralen Transfektion primärer T-Zellen geeignet sind, bietet keine von ihnen die nahtlose Skalierungsfähigkeit, die unserer dünnen Plattengeometrie mit variabler Breite innewohnt. Beispielsweise erreichen Mechanoporationsansätze die Abgabe durch physikalische Verengungen, die die Plasmamembran vorübergehend öffnen41,42. Allerdings erfordert die Skalierung eine Parallelisierung, da die Flussrate und die Kanalabmessungen die Transfektionsparameter beeinflussen.

Obwohl viele Gruppen mikrofluidische, nicht-virale Ansätze entwickeln, die die Lieferung von mRNA-Fracht an primäre T-Zellen demonstrieren, gibt es vergleichsweise wenige Daten zu ihrer Leistung unter Verwendung von Plasmid-DNA28,29,30. Hier demonstrieren wir die effiziente Abgabe von Plasmid-DNA sowohl an Jurkat- als auch an primäre T-Zellen. Im Vergleich zur mRNA-Abgabe erforderte die effiziente Abgabe von Plasmid-DNA, die für GFP kodiert, etwa die doppelte elektrische Feldstärke und führte zu geringeren Transfektionseffizienz-, Lebensfähigkeits- und relativen Ausbeutewerten. Es gibt wahrscheinlich mehrere Erklärungen für die Schwierigkeit bei der Abgabe von Plasmid-DNA, und die genauen Transportmechanismen für den DNA-Elektrotransfer sind noch nicht gut verstanden43,44. Die relative Leichtigkeit der mRNA-Abgabe wird wahrscheinlich durch die Notwendigkeit beeinflusst, dass DNA zur Expression in den Zellkern gelangen muss, und durch die relativ geringe Größe unserer mRNA-Fracht (~ 1 kB) im Vergleich zu unserer Plasmid-DNA-Fracht (~ 3,7 kB). Es wurde bereits berichtet, dass eine zunehmende Plasmidgröße die Transfektionseffizienz und Lebensfähigkeit negativ beeinflusst45. Darüber hinaus weist Plasmid-DNA pathogenassoziierte molekulare Muster auf, wie z. B. unmethylierte CpG-Motive, die Apoptose auslösen können46. Die mit CpG-Motiven verbundene Zytotoxizität könnte unsere Beobachtung erklären, dass eine zunehmende Plasmid-DNA-Konzentration die Lebensfähigkeit der Zellen unabhängig von den Parametern der elektrischen Wellenform verringert. Als die Plasmid-DNA-Konzentration im Elektroporationspuffer anstieg, beobachteten wir eine stärkere GFP-Expression (Daten nicht gezeigt), was auf einen erhöhten Plasmid-Elektrotransfer hindeutet, der auch eine verringerte Lebensfähigkeit der Zellen unabhängig von den Parametern der elektrischen Wellenform erklären könnte. Um Plasmid-DNA effizient an T-Zellen zu liefern, sind DNA-Nanovektorplattformen eine Möglichkeit, die Plasmidgröße durch die Entfernung unnötiger DNA-Sequenzen zu reduzieren, während sie gleichzeitig CpG-Sequenzen im Vektor abbauen, um die Toxizität durch die Entfernung eines pathogenassoziierten molekularen Musters zu verringern8,46.

Die Möglichkeit, ein beliebiges zeitlich veränderliches elektrisches Feld bereitzustellen, bietet einen nahezu unbegrenzten Parameterraum zur Optimierung der Leistung. Wir verwendeten bipolare Wellenformen, um die Auswirkungen elektrochemischer Reaktionen an der Elektrode zu begrenzen und die Ladungsansammlung an den Elektroden zu begrenzen. Die Flexibilität bei der Gestaltung der Wellenform bietet die Möglichkeit, die Lieferung an die jeweilige Ladung anzupassen. Beispielsweise gibt es Hinweise darauf, dass der elektrophoretische Transfer zur Abgabe von Plasmid-DNA beiträgt und zur Entstehung von Wellenformen mit doppelten Spannungen geführt hat, um die Abgabeleistung zu verbessern23,25,26,47. Tatsächlich zeigen wir, dass eine Doppelspannungswellenform die Effizienz der Abgabe von Plasmid-DNA an Jurkat-Zellen verbessern kann. Wir haben auch die Auswirkungen der Variation der Spannungswellenformamplitude sowie der Wellenformfrequenz und damit der Anzahl der Wellenformzyklen, die die fließenden Zellen erfahren, bewertet. Auch die Plasmidkonzentration, Zellkonzentrationen und andere Prozessparameter wurden variiert. Eine Erhöhung der Ladungskonzentration oder eine Erhöhung der Spannungswellenformamplitude führte tendenziell zu einer erhöhten Transfektionseffizienz und einer Verringerung der Lebensfähigkeit. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit zahlreichen früheren Studien, die den Kompromiss zwischen der Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA und der Lebensfähigkeit dokumentieren48,49.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse die Fähigkeiten unserer neuartigen Elektroporationsplattform für die hocheffiziente und lebensfähige Lieferung mehrerer Ladungen an Jurkat- und primäre T-Zellen. Die Innovationen unserer mikrofluidischen Plattform und ihre überlegene Leistung machen sie zu einem vielversprechenden System für die nicht-virale zelluläre Reprogrammierung für Zelltherapien.

Elektroporations-Flow-Chips wurden aus einem dreischichtigen Stapel von Polymersubstraten konstruiert. Alle drei Schichten wurden mit einem hochauflösenden CO2-Laser mit kleinem Strahlpunkt lasergeschnitten. Die aus 1 mm dicken Acrylplatten (McMaster Carr, Robbinsville, NJ, USA) geschnittenen Ober- und Unterschichten bilden den Boden und die Dichtungskanaloberflächen. Die mittlere Schicht war ein Abstandshalter, der die Kanaltiefe und -breite definierte und aus einem hydrophilen, dünnen, druckempfindlichen Klebeband bestand. Die Hydrophilie des Abstandshalters zog Lösungen auf Wasserbasis an, um das Einschließen von Luft beim Füllen des Mikrofluidikkanals zu verhindern. Zur Herstellung des Chips wurden die untere und obere Acrylschicht per Laser in 1″ × 2″ große Stücke geschnitten. Anschließend wurden die Teile lasergeschnitten, um Flüssigkeitseinlass-/-auslassöffnungen und Ausrichtungslöcher für den Montageprozess hinzuzufügen. Jedes Acrylstück wurde mit Wasser und dann Isopropylalkohol gereinigt. Anschließend wurden in der Cornell NanoScale Facility (CNF) mithilfe einer Maske eine dünne Haftschicht aus Titan und eine Dünnfilmelektrode aus Gold durch physikalische Gasphasenabscheidung mit einem CVC SC4500-Elektronenkanonenverdampfungssystem auf der Innenfläche jedes Acrylstücks abgeschieden. Die Mittelschicht wurde zugeschnitten und erhielt durch das Laserschneidverfahren auch die entsprechenden Ausrichtungslöcher. Um Luftblasen beim Befüllen der 10 mm breiten Kanäle zu vermeiden, wurde der Kanal mit einer konischen Geometrie an den Flüssigkeitseinlass- und Flüssigkeitsauslassöffnungen entworfen. Die dreiteilige Sandwichanordnung (Acryl, Polymerfolie, Acryl) wurde dann in einer Presse druckverklebt.

Primäre T-Zellen wurden von StemCell Technologies gekauft, das Pan-T-Zellen von normalen Spendern mittels negativer immunomagnetischer Trennung isolierte. Primäre T-Zellen wurden in ImmunoCult-Medien ohne tierische Produkte, ergänzt mit 100 µg/ml rekombinantem menschlichem IL-2 (StemCell, Vancouver, BC, Kanada), kultiviert. Primäre T-Zellen wurden aufgetaut, über Nacht im Medium ruhen gelassen und anschließend gemäß den Anweisungen des Herstellers mit CD3/CD28-Antikörpern (StemCell) aktiviert. Vier Tage nach der Aktivierung wurden die Zellen zur Transfektion geerntet. Jurkat-Zellen wurden von Millipore Sigma (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA) gekauft und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten.

pCMV-GFP (Plasmid-DNA; 3705 bp) wurde von Altogen Biosystems (Las Vegas, NV, USA) gekauft. Dasher GFP-mRNA (1 kb) wurde von Aldevron gekauft. SpCas9 und sgRNA, die auf den TRAC- oder TRBC-Locus abzielen (TRAC: 5'-AGAGUCUCUCAGCUGGUACA-3 '; TRBC: 5'-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3'), wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) erworben. Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe wurden durch Mischen äquimolarer Mengen von SpCas9 und jeder sgRNA und 10-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur vor der Zugabe zu Zellsuspensionen in Elektroporationspuffer gebildet.

Für Elektroporationsexperimente wurden die Zellen zweimal in BTXpress Cytoporation-Elektroporationspuffer mit niedriger Leitfähigkeit (Leitfähigkeit: 9 × 10–3 S/m; Holliston, MA, USA) geerntet, gezählt und gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurden die Zellen im gleichen Elektroporationspuffer mit einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert, sofern nicht anders angegeben. Anschließend wurde für jedes Experiment die anzuliefernde Ladung in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Wässrige Lösungen, die Zellen und Fracht enthielten, wurden dann in eine Spritze geladen, die dann in eine Spritzenpumpe (Chemyx, Stafford, TX, USA) geladen wurde. Sofern nicht anders angegeben, wurden Zellsuspensionen kontinuierlich mit 320 µL/min (2 mm Kanalbreite) oder 1600 µL/min (10 mm Kanalbreite) in die Durchflusszelle eingespeist. Beim Durchgang der Zellen unter der Elektrode wurden sie der angegebenen willkürlichen Spannungswellenform ausgesetzt, die von einem Funktionsgenerator (Siglent SDG 1032X; Siglent, Technologies, Solon, OH, USA) erzeugt und von einem HF-Verstärker (TS250; Accel Instruments, Irvine, USA) verstärkt wurde. CA, USA). Sobald die Zellen den Auslass verlassen, werden sie von einem speziell angefertigten Roboter-Fraktionssammler in Vertiefungen mit vorgewärmtem Zellmedium verteilt. Die Anzahl der Wellenformen, die Zellen beim Durchgang unter der Elektrode erfahren, wird berechnet als:

wohingegen die lineare Geschwindigkeit der Zellen berechnet wird als

Während jedes Experiments wurden der Funktionsgenerator und das Oszilloskop mithilfe eines benutzerdefinierten MATLAB-Programms gesteuert, um über die Dauer des Experiments ein bis zehn vorprogrammierte beliebige Spannungswellenformen zu liefern (Version 2021a, Mathworks, Natick, MA, USA). Die Wellenformumschaltung und der Roboter-Autosampler wurden so programmiert, dass jede Vertiefung eine größtenteils reine Zellpopulation enthielt, die eine vorprogrammierte Spannungswellenform empfing. Spannungswellenformen und die Spannung an einem 1-Ω-Widerstand in Reihe mit dem Durchflusschip wurden mit einem Oszilloskop (Siglent SDS1104X-E, Siglent Technologies) überwacht. Transfektionseffizienz, Zelllebensfähigkeit und relative Ausbeute wurden 24 Stunden nach der Transfektion (sofern nicht anders angegeben) mittels Durchflusszytometrie gemessen.

Für Gene Pulser-Experimente wurden Zellen geerntet, gezählt und zweimal in Gene Pulser Electroporation Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurden die Zellen im gleichen Elektroporationspuffer bei einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Anschließend wurde für jedes Experiment die anzuliefernde Ladung in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Wässrige Lösungen, die Zellen und Ladung enthielten, wurden dann in eine 4-mm-Küvette (Bio-Rad) geladen und mit einem Gene Pulser ). Nach dem Pulsieren wurden die Zellen sofort auf eine 24-Well-Platte mit vorgewärmtem Medium übertragen. Die Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion mittels Durchflusszytometrie gemessen.

Primäre T- oder Jurkat-Zellen wurden 24 Stunden (GFP-Expression) oder 72 Stunden (TCR-α) nach der Transfektion zur Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung eines ZE5-Zellanalysators (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) entnommen. Die TCR-Expression wurde durch Anfärben primärer T-Zellen mit dem Anti-Human-TCR-Antikörper AlexaFluor 488 in einer Verdünnung von 1:50 (BioLegend, San Diego, CA, USA; Katalognummer 306712) gemessen. Die Lebensfähigkeit wurde gemessen, indem die Zellen mit dem Lebensfähigkeitsfarbstoff 7-AAD gefärbt und vor der Durchflussanalyse 5 Minuten lang inkubiert wurden (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA). Während der Flussanalyse wurden die Zellen zunächst mit einem Gatter versehen, um Zelltrümmer auszuschließen, indem die Fläche der Vorwärtsstreuung (FSC) vs. die Fläche der Seitenstreuung (SSC) aufgetragen wurde (Zellmorphologie in Abb. 3A, B). Einzelne Zellen wurden anschließend mithilfe von FSC-Flächen- und FSC-Höhendiagrammen erfasst. Um die Lebensfähigkeit zu messen, wurden einzelne Zellen kontrolliert, um den Prozentsatz der 7-AAD-negativen (lebenden) und positiven (toten) Populationen zu messen (Lebensfähigkeit in Abb. 3A, B). Um die GFP- oder TCR-Expression zu messen, wurden lebensfähige Zellen kontrolliert, um den Prozentsatz der Zellen mit grüner Fluoreszenz im Vergleich zu Nullspannungskontrollen zu messen (GFP in Abb. 3A, B).

Die Anzahl der unabhängigen Experimente für jeden Datensatz (n) ist in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle Analysen und Darstellungen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor, HGC, erhältlich.

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Diese Arbeit wurde teilweise in der Cornell NanoScale Facility (CNF) durchgeführt, einem Mitglied der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), die von der National Science Foundation (Grant NNCI-2025233) unterstützt wird.

CyteQuest, Inc, 95 Brown Road, Box 1011, Ithaca, NY, 14850, USA

Jacob A. VanderBurgh, Thomas N. Corso, Stephen L. Levy und Harold G. Craighead

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Konzeptualisierung: JAV, TNC, SLL, HGC; Methodik: JAV, TNC, SLL, HGC; Validierung: JAV; formale Analyse: JAV; Untersuchung: JAV; Schreiben – Originalentwurf: JAV; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: JAV, TNC, SLL, HGC; Visualisierung: JAV; Aufsicht: JAV, TNC, SLL, HGC; Projektverwaltung: JAV, TNC, SLL, HGC; Finanzierungseinwerbung: TNC, SLL, HGC

Korrespondenz mit Harold G. Craighead.

JAV, TNC und HGC werden als Erfinder in Patentanmeldungen im Zusammenhang mit der vorgestellten Technologie aufgeführt und JAV, TNC, SLL und HGC haben ein finanzielles Interesse an CyteQuest.

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Nachdrucke und Genehmigungen

VanderBurgh, JA, Corso, TN, Levy, SL et al. Skalierbare Plattform für kontinuierliche Elektroporation, die die Transfektion von T-Zellen für die Herstellung von Zelltherapien ermöglicht. Sci Rep 13, 6857 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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Eingegangen: 26. Juli 2022

Angenommen: 21. April 2023

Veröffentlicht: 26. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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