Strukturierte Verfolgung der Alkoholverstärkung (STAR) für die grundlegende und translationale Alkoholforschung
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Strukturierte Verfolgung der Alkoholverstärkung (STAR) für die grundlegende und translationale Alkoholforschung

Aug 10, 2023

Molecular Psychiatry Band 28, Seiten 1585–1598 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Es besteht eine inhärente Spannung zwischen den Methoden, die zur Beantwortung grundlegender Forschungsfragen in Modellspezies entwickelt wurden, und solchen, die für die präklinische in die klinische Umsetzung gedacht sind: Grundlegende Untersuchungen erfordern Flexibilität beim experimentellen Design, da Hypothesen schnell getestet und überarbeitet werden, während präklinische Modelle standardisierte Protokolle und spezifische Ergebnismaße in den Vordergrund stellen. Diese Dichotomie ist besonders relevant in der Alkoholforschung, die neben intensiven Bemühungen zum Verständnis der Pathophysiologie der Alkoholkonsumstörung (AUD) ein breites Spektrum an Grundlagenwissenschaften umfasst. Um diese Ziele voranzutreiben, besteht ein großer Bedarf an Ansätzen, die Synergien zwischen grundlegenden und translationalen Bereichen der nichtmenschlichen Alkoholforschung ermöglichen. Bei männlichen und weiblichen Mäusen etablieren wir ein modulares Alkoholverstärkungsparadigma: Structured Tracking of Alcohol Reinforcement (STAR). STAR bietet eine robuste Plattform für die quantitative Bewertung AUD-relevanter Verhaltensbereiche in einem flexiblen Rahmen, der einen direkten Austausch zwischen translationalen und mechanistisch orientierten Studien ermöglicht. Um trotz unterschiedlicher Aufgabenparameter eine studienübergreifende Integration zu erreichen, wird eine einfache multivariate Phänotypisierungsanalyse verwendet, um Probanden anhand ihrer Neigung zu erhöhtem Alkoholkonsum und ihrer Unempfindlichkeit gegenüber Strafen zu klassifizieren. Durch die Kombination von STAR mit vorhandenen präklinischen Alkoholmodellen beschreiben wir die Dynamik des Längsphänotyps und decken mutmaßliche Neurobiomarker für eine erhöhte Anfälligkeit für Alkoholkonsum durch neurochemische Profilierung von kortikalen und Hirnstammgeweben auf. Zusammen ermöglicht STAR die Quantifizierung zeitaufgelöster bioverhaltensbezogener Prozesse, die für grundlegende Forschungsfragen unerlässlich sind, gleichzeitig mit der longitudinalen Phänotypisierung klinisch relevanter Ergebnisse und bietet so einen Rahmen zur Erleichterung des Zusammenhalts und der Übersetzung in der Alkoholforschung.

Alkohol (Ethanol) gehört zu den am meisten untersuchten chemischen Verbindungen der Geschichte [1] und stößt weiterhin auf großes Interesse bei Grundlagenforschern aus einem breiten Spektrum von Disziplinen, darunter Strukturchemie [2], Pharmakologie [3], Toxikologie [4] und Physiologie [ 5], Evolutionsbiologie [6], Neurowissenschaften [7] und Reinforcement Learning [8]. Alkohol wird wegen seiner psychoaktiven Eigenschaften häufig konsumiert [9] und obwohl schwerwiegende Nebenwirkungen nur bei einem Teil der Trinker auftreten [10], bleibt der Alkoholkonsum eine anhaltende globale Gesundheitskrise, die für mehr als 5 % aller vorzeitigen Todesfälle weltweit verantwortlich ist [11]. Daher gibt es seit langem Bemühungen in der translationalen und klinischen Forschung, die darauf abzielen, die biologischen Folgen des Alkoholkonsums zu verstehen, um therapeutische Interventionen für die Alkoholkonsumstörung (AUD) zu entwickeln [12, 13]. Es mangelt jedoch an Methoden, die es Forschern verschiedener Disziplinen ermöglichen, Alkohol in einem gemeinsamen Rahmen zu untersuchen, was wahrscheinlich eine verpasste Chance darstellt, Fortschritte sowohl bei grundlegenden als auch bei translationalen Endpunkten zu ermöglichen.

Um die gewonnenen Erkenntnisse und Fortschritte zu maximieren, ist eine Integration über die äußerst unterschiedlichen Teilbereiche der Alkoholforschung an nichtmenschlichen Probanden erforderlich [14, 15]. Tatsächlich zeigen retrospektive Auswertungen von Tierkrankheitsmodellen den Nutzen von Rahmenwerken, die den Forschern explizit Möglichkeiten zur Synthese von Erkenntnissen bieten und für Kontinuität über Teilbereiche hinweg sorgen [16,17,18,19,20,21]. In Ermangelung einer gezielten Entwicklung methodischer Lösungen besteht eine natürliche Tendenz, dass sich die Fachgebiete entlang grundlegender und translationaler Linien aufspalten, da hochspezialisierte Paradigmen auf teilweise unterschiedliche Ziele ausgerichtet werden: Grundlegende Untersuchungen erfordern Flexibilität bei der experimentellen Gestaltung, da Hypothesen schnell getestet und überarbeitet werden. während Tiermodelle, die für die präklinische in die klinische Übersetzung gedacht sind, Wert auf standardisierte Protokolle legen, um einen Vergleich spezifischer Ergebnismaße zu ermöglichen [22, 23]. Die Tendenz bei grundlegenden experimentellen Studien und präklinischen Tests, sich nicht überschneidende Methoden zu verwenden, ohne ausdrückliche Bemühungen, Schlussfolgerungen zu integrieren, behindert Fortschritt und Übersetzung [18, 24, 25, 26]. Dementsprechend wird die Verwendung flexibler Verfahren, die experimentatorspezifische Änderungen ermöglichen und gleichzeitig die konzeptionelle Konsistenz wahren, im Gegensatz zu starren Protokollen wahrscheinlich bahnbrechende Entdeckungen katalysieren [16, 27, 28, 29, 30].

Hier versuchten wir, ausgehend von metaanalytischen Bewertungen von Erfolgen und Mängeln in der präklinischen Krankheitsforschung, ein zusammenhängendes Modell zu entwerfen, um grundlegende und translationale Untersuchungen zur biologischen Verhaltensaktivität von Alkohol zu verbinden. Bei männlichen und weiblichen Mäusen etablieren wir das Structured Tracking of Alcohol Reinforcement (STAR)-Framework, das ein Schema zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Alkoholverstärkung und zum Alkoholkonsum bei gleichzeitiger Bewertung multivariater Trinkergebnisse und erfahrungsabhängiger Phänotypdynamik bereitstellt. Das STAR-Framework nutzt die operante Selbstverabreichung von Alkohol, die es Experimentatoren durch Modifizierung von Verstärkungsplänen ermöglicht, eine breite Palette von Prozessen abzufragen [31, 32]. Das verbindende Element von STAR ist die Bewertung zweier Ergebnismaße mit Vorhersage- und Konstruktvalidität innerhalb eines Verstärkungsrahmens: Alkoholkonsum und fortgesetztes Trinken trotz Bestrafung. Anstelle eines starren Protokolls implementiert STAR eine multivariate Phänotypisierungsanalyse, um Probanden basierend auf der relativen Varianz des Alkoholkonsums und der Strafempfindlichkeit zu kategorisieren. Durch die Beschreibung des Ausdrucks der großen individuellen Unterschiede, die durch diese Verhaltensweisen hervorgerufen werden, mithilfe gruppennormalisierter Werte werden robuste Phänotypen über eine Reihe experimenteller Szenarien hinweg konsistent erfasst. STAR verfügt über die verfahrenstechnische Flexibilität, die zur Verfolgung grundlegender Forschungsfragen erforderlich ist, bietet hochauflösende Zeitreihenauslesungen von Appetit- und Konsumverhalten und ist so optimiert, dass eine nahtlose Anbindung an Neurotechnologien zur Echtzeitabfrage der biologischen Grundlagen der Alkoholverstärkung möglich ist. Entscheidend ist, dass das STAR-Framework ausdrücklich darauf ausgelegt ist, eine Integration und nicht einen Wettbewerb mit den verschiedenen vorhandenen Modellen zu ermöglichen, die im präklinischen Alkoholbereich entwickelt wurden [13, 33, 34, 35]. Diese Funktionen sollen die interdisziplinäre Kommunikation erleichtern und den translationalen Wert bei minimalen Einschränkungen beim experimentellen Design steigern.

Zu diesem Zweck etablieren und parametrisieren wir das STAR-Framework, demonstrieren die Integration mit gängigen Alkoholexpositionsmethoden, stellen ein öffentlich zugängliches Protokoll-Repository bereit und nutzen die gekoppelte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse (LC-MS) von Kortikalis- und Hirnstammgeweben, um die Neurochemie aufzudecken Signaturen, die mit einem erhöhten AUD-relevanten Trinkverhalten verbunden sind. Gemeinsam erarbeiten wir einen neuartigen Rahmen, der die Anhäufung von Wissen erleichtern soll, das durch unterschiedliche Methoden in verschiedenen Alkohol-Teilbereichen gewonnen wurde, und gleichzeitig die studienübergreifende Vergleichbarkeit mithilfe eines standardisierten Prozesses zur multivariaten Phänotypklassifizierung gewährleisten soll.

Um das Design des STAR-Frameworks zu gestalten, haben wir uns die jüngsten Bemühungen in mehreren Bereichen zunutze gemacht, Merkmale präklinischer Modelle zu identifizieren, die die Wahrscheinlichkeit einer Übertragung vom Tier auf den Menschen erhöhen. Konsistente Themen in der Literatur umfassen die Notwendigkeit (1) quantitativer Ergebnismessungen für bestimmte Krankheitssubdomänen (anstatt zu versuchen, die Störung als Ganzes zu modellieren), (2) die Nutzung der Probenheterogenität, um krankheitsrelevante Phänotypen mithilfe leicht anwendbarer Methoden zu definieren sowohl von Grundlagenforschern als auch von Klinikern verstanden werden, und (3) verstärkte Betonung von Verhaltensendpunkten, die die biologischen Grundlagen bei Tieren und Menschen erhalten haben [13, 21, 24, 25, 28, 29, 36, 37, 38, 39]. Alkoholkonsum und zwanghaftes Trinken (hier operativ definiert als der Grad, in dem der Konsum durch Bestrafung moduliert wird) sind beide von zentraler Bedeutung für die AUD-Symptomatik und sind beobachtbare Variablen, die bei Tieren leicht quantifiziert werden können [40,41,42]. Wir haben kürzlich Aktivitätsmuster in einer Population von Neuronen, die vom präfrontalen Kortex in die periaquäduktale Grauzone projizieren, als mutmaßlichen Neurobiomarker identifiziert, der niedrige Alkoholaufnahme, hohe Alkoholaufnahme und zwanghafte Trinkgewohnheiten bei Mäusen unterscheidet [43]. Anschließend wurden diese Ergebnisse explizit in zwei separaten Studien am Menschen ausgewertet, die beide hochgradig kongruente Zusammenhänge zwischen der kortikalen Hirnstammaktivität und der Anfälligkeit für Alkoholkonsum fanden [44, 45]. Zusammengenommen liefert dies eine starke Unterstützung für die Idee, dass ein quantitativer Rahmen, der sich auf individuelle Unterschiede konzentriert, die intersektional durch Alkoholkonsum und zwanghaften Alkoholkonsum definiert werden, eine Möglichkeit darstellen könnte, die drei oben genannten Empfehlungen zu erfüllen. Hier formalisieren wir einen Rahmen für die Quantifizierung dieser Bereiche im Rahmen einer flexiblen Verstärkungslernaufgabe und stellen öffentlich verfügbare Protokolle und Ressourcen bereit, die zusammen eine einfache Übertragung dieses Ansatzes auf Laboratorien und experimentelle Fragestellungen ermöglichen.

Die unabdingbaren Komponenten des STAR-Frameworks sind die operante Selbstverabreichung von Alkohol, bei der Anstrengungen erforderlich sind, um Zugang zu Alkohol zu erhalten (Abb. 1A), und eine einfache, standardisierte Methode der multivariaten Phänotypisierung, bei der Probanden anhand der relativen Varianz des Alkohols klassifiziert werden Trinken und Trinken trotz Strafe (z. B. zwanghaftes Trinken) (Abb. 1B). Basierend auf dem Alkoholkonsum während bestrafter und ungestrafter Alkohol-Selbstverabreichungssitzungen werden die Probanden in einen von drei Phänotypen eingeteilt: (1) „Geringe Trinker“ weisen sowohl mit als auch ohne Bestrafung einen unterdurchschnittlichen Alkoholkonsum auf, (2) „Vieltrinker“ weisen einen überdurchschnittlichen Alkoholkonsum auf Konsum von Alkohol allein, aber unterdurchschnittlicher Konsum bei Bestrafung, und (3) „Zwangstrinker“ weisen trotz Bestrafung einen überdurchschnittlichen Alkoholkonsum auf (Abb. 1B).

A Die primäre Methodik des STAR-Frameworks ist die Bewertung des Alkoholkonsums während einer Alkoholverstärkungsaufgabe, bei der die Reaktion im Rahmen eines Verstärkungsplans mit festem Verhältnis von 10 durch Verlängerung des Alkoholtrinkers für 10 Sekunden verstärkt wird. B Erkenntnisse aus verschiedenen Verfahren zur Alkoholverstärkung werden mithilfe einer einfachen Phänotypisierungsanalyse in einen gemeinsamen konzeptionellen Rahmen integriert, um Probanden auf der Grundlage des Alkoholkonsums und des fortgesetzten Alkoholkonsums trotz Bestrafung zu kategorisieren. C Experimentelle Zeitleiste. Hier verwendeten wir das STAR-Framework, um die Entstehung individueller Unterschiede im Laufe der Zeit und des Trinkerlebnisses zu untersuchen. Alle Probanden werden unter identischen Versuchsbedingungen getestet und die Gruppenzuordnung erfolgt auf Grundlage der Phänotypisierung anhand der Daten nach dem Test. Alkoholkonsum (D) und operative Reaktion (E) über drei Sitzungen zur Selbstverabreichung von Alkohol. Anschließend werden der Alkohollösung über mehrere Sitzungen hinweg abgestufte Chininkonzentrationen zugesetzt, um die Empfindlichkeit der Alkoholverstärkung gegenüber Bestrafung zu testen. Anschließend wird den Tieren im Rahmen eines Zwei-Flaschen-Auswahlverfahrens freier Zugang zu Alkohol gewährt, was zu einem hohen Alkoholkonsum (F) und einer Alkoholpräferenz im Vergleich zu Wasser (G) führt. Während der STAR-Phänotypisierungssitzungen gab es große individuelle Unterschiede beim Alkoholkonsum mit und ohne Chininstrafe (H) sowie bei der Reaktion des Operanten auf Alkoholzugang (I). Wenigtrinker, n = 19; Vieltrinker, n = 5; Zwanghafte Trinker, n = 17. Fehlerbalken zeigen SEM an.

Hier implementieren wir das STAR-Framework, um die Längsdynamik beim Ausdruck phänotypischer Trinkverhaltensweisen zu untersuchen und zu untersuchen, inwieweit sich durch Alkoholkonsum und zwanghaftes Trinken definierte Phänotypen auf andere relevante Bereiche übertragen lassen. Wichtig ist, dass die durchgehend beschriebenen Parameter ausgewählt wurden, um diese spezifischen Fragen zu verfolgen, und die Begründung für diesen Entwurf wird durchgehend detailliert beschrieben. Wir haben detaillierte Protokolle und Verhaltenscodes bereitgestellt, um eine einfache Implementierung zu ermöglichen (siehe „Methoden“), die Parameter sollten jedoch nach Bedarf geändert werden, um die jeweilige Frage bestmöglich zu verfolgen, vorausgesetzt, dass die Definitionen und Berechnungen der Phänotypisierungsanalyse selbst konsistent sind.

Wir wollten zunächst feststellen, ob phänotypische Unterschiede im Alkoholkonsum während der anfänglichen Alkoholexposition beobachtet werden können, und die Entwicklung dieser Verhaltensweisen in Bezug auf die erste Gelegenheit zum Trinken bis hin zur Vergiftung bei männlichen Mäusen beurteilen. Um das Trinkverhalten in einem Paradigma des verstärkenden Lernens zu beurteilen, müssen Tiere zunächst eine operante Kontingenz erlernen. Für eine klare Interpretation des Verhaltens zu diesem Zeitpunkt ist es notwendig, das operante Lernen von den motivierenden Eigenschaften des Alkohols zu trennen (46). Typischerweise wird der Erwerb der Selbstverabreichung von Alkohol in Nagetiermodellen durch die Zugabe von Süßungsmitteln [47] oder durch vorherige, nicht bedingte Alkoholexposition [48, 49, 50, 51] erleichtert, was beides eine klare Beurteilung der Verstärkung und des Trinkverhaltens erschweren würde während des gesamten Beginns des Alkoholkonsums. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein Protokoll für ein kontrolliertes Operantentraining entwickelt, bei dem Mäuse darauf konditioniert werden, auf den Zugang zu Alkohol zu reagieren, ohne dass Süßstoffe oder eine vorherige Exposition erforderlich sind, und die Möglichkeit zum Alkoholkonsum begrenzt ist, bis die Kriterien des Operantenlernens erfüllt sind. Um den Konsum zu kontrollieren, wurde der Alkoholkonsum während aller Erfassungssitzungen begrenzt, wobei die Sitzungen abgebrochen wurden, wenn 100 Lecks registriert wurden. In einer standardmäßigen operanten Konditionierungskammer wurden die Tiere zunächst darauf trainiert, an einem Trinkschlauch, der Alkohol (Ethanol in Wasser, 15 % v/v) enthielt, nach Alkohol zu lecken, was eine Stunde lang oder bis 100 Lecks, je nachdem, was zuerst eintrat, so blieb. Um Zugang zum Alkoholtrinker zu erhalten, mussten die Tiere anschließend auf einen Nasenstoß unter verschiedenen Verstärkungsplänen reagieren (Abb. S1). Die Reaktion wurde zunächst nach einem Zeitplan mit festem Verhältnis 1 (FR 1) verstärkt, wobei eine einzelne Reaktion auf den aktiven Nasenstoß zu einer 30-sekündigen Verlängerung des Sipper-Rohrs führte (Abb. S1A–D). Unter Verwendung abgestufter Kriterien (siehe „Methoden“) wurde die Reaktionsanforderung erhöht und die Zugangsdauer über die Sitzungen hinweg verkürzt, bis die Tiere im Rahmen eines FR 5-Zeitplans für 10 Sekunden Alkoholzugang eine klare Unterscheidung zwischen aktivem und inaktivem Nasenstoß zeigten (Abb. S1E). –L).

Dieses Protokoll führt zum Erwerb einer operanten Alkoholselbstverabreichung mit geringen Fluktuationsraten (87 % erworben, Abb. S2A, B). Darüber hinaus kann durch die Festlegung einer festen Grenze für die Einnahme pro Sitzung eine Untersuchung des anfänglichen Verhaltens bei der Selbstverabreichung von Alkohol durchgeführt werden, unabhängig von vermischenden Variablen im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Lernrate, was zu einer erhöhten Selbstverabreichung unabhängig von der Trinkneigung an sich und den Grenzwerten führen kann Varianz der früheren Alkoholexposition zwischen den Probanden (Abb. S2C). Die am Alkoholtrinker registrierten Leckkontakte wurden über viele Sitzungen hinweg mit und ohne Festlegung einer maximalen Leckzahl bewertet. Es wurde festgestellt, dass sie stark mit der volumetrischen Beurteilung des konsumierten Alkohols sowie der daraus resultierenden Blutalkoholkonzentration korrelieren und daher eine zuverlässige Zeit liefern -Aufgelöste Anzeige des Alkoholkonsums während der gesamten Sitzung (Abb. S3). Wichtig ist, dass dieses Erfassungsprotokoll zwar nützlich ist, um die vorliegende experimentelle Frage, das Selbstverwaltungsverhalten bei der ersten Gelegenheit zum Trinken, zu analysieren, es jedoch kein erforderliches Merkmal des STAR-Frameworks ist; Wie bereits erläutert, ermöglicht die Verwendung der normalisierten Phänotypisierung die Manipulation experimenteller Parameter nach Bedarf unter Beibehaltung eines gemeinsamen Rahmens.

Sobald die Akquisitionskriterien erfüllt waren, wurde die Reaktion während aller nachfolgenden Selbstverwaltungssitzungen durch einen FR-10-Zeitplan für 10-sekündigen Zugriff auf den Sipper verstärkt (Abb. 1A). Die Tiere wurden in drei täglichen einstündigen Sitzungen getestet und durften auf Alkohol reagieren und ihn trinken, ohne dass während der Akquisitionssitzungen die Ableckkappen-Beschränkung auferlegt wurde, um individuelle Unterschiede in der Neigung zu beurteilen, Alkohol zu bekommen und zu konsumieren, wenn die Probanden zum ersten Mal Gelegenheit hatten, bis zur Vergiftung zu trinken (Abb. 1D, E). Als nächstes wurde Alkohol mit steigenden Konzentrationen des bitter schmeckenden Chinin über Sitzungen hinweg verfälscht (0,25, 0,5, 0,75, 1 mM), um den Alkoholkonsum angesichts einer Strafe (z. B. zwanghaftes Trinken) zu beurteilen. Diese erste Beurteilung des Alkoholkonsums und der Empfindlichkeit gegenüber der Bestrafung durch Chinin wird durchgehend als Prä-Binge-Phase bezeichnet.

Neben der Berücksichtigung multimodaler Verhaltensbereiche, die zu Krankheitszuständen wie AUD beitragen [52, 53], hat die klinische Forschung zunehmend die Bedeutung der Quantifizierung longitudinaler Veränderungen in der Ausprägung dieser Merkmale hervorgehoben [54, 55, 56]. Präklinische Modelle, bei denen die Einschränkungen querschnittlicher experimenteller Designs leicht umgangen werden können, haben einen einzigartigen Nutzen für die Längsschnittanalyse der Entwicklung AUD-relevanter Verhaltensweisen; [57, 58] Es gibt jedoch nur wenige Tierstudien, die die longitudinale Phänotypdynamik des Alkoholtrinkverhaltens quantifizieren [13, 59]. Zu diesem Zweck haben wir als nächstes das STAR-Framework verwendet, um die Entwicklung des Trinkverhaltens im Laufe der Zeit und Erfahrung zu untersuchen. Nach der Bewertung des Selbstverabreichungsverhaltens vor dem Alkoholkonsum wurde den Mäusen in einem Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren freier Zugang zu Alkohol gewährt, basierend auf dem „Drinking in the Dark“-Paradigma [60, 61], aber mit gleichzeitigem Zugang zu Wasser, für 0, 2- oder 4-ha-Tag (Abb. 1C). Die Zwei-Flaschen-Wahl, bei der den Tieren Zugang zu einer Wasserflasche und einer Alkoholflasche gewährt wird, ist eines der am weitesten verbreiteten Tiermodelle für den Alkoholkonsum [62]. Dieser Ansatz hat viele Varianten, aber im Allgemeinen führen Open-Access-Protokolle zu einem hohen Aufnahmeniveau bei relativ geringer individueller Varianz [43, 63]. Nach zweiwöchiger Testung im Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren (Abb. 1F-G) wurden die Tiere zur Beurteilung des Alkoholkonsums und des bestrafungsempfindlichen Trinkens unter identischen Bedingungen wie bei Selbstverabreichungssitzungen vor dem Alkoholexzesse in die operante Konditionierungskammer zurückgebracht ( Abb. 1H–I). Diese Sitzungen wurden verwendet, um eine STAR-Phänotypisierung durchzuführen, wobei jedes Tier den Gruppen „Niedriger“, „Starker“ oder „Zwangstrinker“ zugeordnet wurde und die Gruppenzuordnung dann auf den gesamten Datensatz angewendet wurde.

Während der Selbstverabreichung vor dem Essanfall gab es nur begrenzte Unterschiede zwischen den Probanden (Abb. 2A). Wir fanden keine Unterschiede zwischen den Phänotypen beim Alkoholkonsum (Abb. 2B), aber zwanghafte Trinker zeigten während der Selbstverabreichung von unverfälschtem Alkohol vor dem Alkoholkonsum eine erhöhte Reaktion des Operanten auf Trinkgeldzugang (Abb. 2C). Die Phänotypen unterschieden sich bei der Selbstverabreichung, wenn der Alkoholkonsum durch Chininverfälschung bestraft wurde, wobei zwanghafte Trinker eine höhere Aufnahme aufwiesen als Personen mit geringem und hohem Alkoholkonsum (Abb. 2D). Sowohl Zwangstrinker als auch Vieltrinker reagierten während der Chininverfälschungssitzungen häufiger als Wenigtrinker (Abb. 2E).

A Pre-Binge: normalisierte Verteilungen des Alkoholkonsums (y-Achse) und des Alkoholkonsums während Chinin-Sitzungen (x-Achse) aus Selbstverabreichungssitzungen vor dem Test. B Die Aufnahme während der drei Selbstverabreichungssitzungen vor dem Alkoholexzesse unterscheidet sich nicht je nach Phänotyp (verschachtelte einfaktorielle ANOVA, F(2, 6) = 1,691, p = 0,2615; 3 Gruppen, 3 Tage pro Gruppe, 122 Gesamtwerte ). C Die Reaktionen auf aktives Nasenstechen in den drei Selbstverabreichungssitzungen vor dem Rauschalkohol unterscheiden sich je nach Phänotyp, wobei zwanghafte Trinker stärker reagierten als Menschen mit geringem Alkoholkonsum (verschachtelte einfaktorielle ANOVA, F(2, 119) = 4,667, p = 0,0112; 3). Gruppen, 3 Tage pro Gruppe, 122 Gesamtwerte). D Die Aufnahme während der Sitzungen zur Selbstverabreichung von Alkohol und Chinin vor einem Alkoholexzesse unterscheidet sich je nach Phänotyp, wobei die Aufnahme bei zwanghaften Trinkern höher ist als bei Personen mit geringem oder hohem Alkoholkonsum (verschachtelte einfache ANOVA, F(2, 161) = 15,31, p < 0,0001; 3 Gruppen). , 4 Tage pro Gruppe, 164 Gesamtwerte). E Aktive Nasenstichreaktionen während Sitzungen zur Selbstverabreichung von Alkohol und Chinin vor dem Alkoholexzesse unterscheiden sich je nach Phänotyp, wobei zwanghafte und starke Trinker im Vergleich zu niedrigen Trinkern höhere Antwortraten aufweisen (verschachtelte einfache ANOVA, F(2, 161) = 20,32, p < 0,0001; 3 Gruppen, 4 Tage pro Gruppe, 164 Gesamtwerte). F Post-Binge: normalisierte Verteilungen des Alkoholkonsums (y-Achse) und des Alkoholkonsums während Chininsitzungen (x-Achse) aus Selbstverabreichungssitzungen nach dem Binge. G Starke und zwanghafte Trinker zeigen in den drei Selbstverabreichungssitzungen nach dem Alkoholexzesse einen höheren Alkoholkonsum im Vergleich zu Geringtrinkern (verschachtelte einfache ANOVA, F(2, 6) = 20,13, p = 0,0022; 3 Gruppen, 3 Tage). pro Gruppe, 122 Gesamtwerte). H-starke und zwanghafte Trinker zeigen in den drei Selbstverabreichungssitzungen nach B-Alkohol im Vergleich zu niedrigen Trinkern (verschachtelte einfaktorielle ANOVA, F(2, 120) = 44,15, p < 0,0001; 3 Gruppen) höhere aktive Nasenstoßreaktionen , 3 Tage pro Gruppe, 123 Gesamtwerte). I Zwanghafte Trinker haben in den vier Selbstverabreichungssitzungen nach dem Alkoholexzess eine höhere Aufnahme von Alkohol + Chinin als Viel- und Niedrigtrinker (verschachtelte einfache ANOVA, F(2, 9) = 44,90, p < 0,0001; 3 Gruppen, 4 Tage). pro Gruppe, 164 Gesamtwerte). J Starke und zwanghafte Trinker zeigen in den vier Selbstverabreichungssitzungen nach dem Alkohol- und Chininkonsum nach dem Rausch im Vergleich zu Menschen mit geringem Alkoholkonsum eine höhere aktive Nase-Stich-Reaktion (verschachtelte einfache ANOVA, F(2, 161) = 50,92, p < 0,0001; 3). Gruppen, 4 Tage pro Gruppe, 164 Gesamtwerte). Bei allen Post-hoc-Vergleichen wurde der Tukey-Test verwendet: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Tage nur mit Alkohol: 3 Gruppen x 3 Tage (Geringe Trinker, n = 19; Viel Trinker, n = 5 Zwangstrinker, n = 17); Alkohol+Chinin-Tage 3 Gruppen x 4 Tage (Geringe Trinker, n = 19; Viel Trinker, n = 5 Zwangstrinker, n = 17). Fehlerbalken zeigen SEM an.

Die Phänotypen unterschieden sich im Gesamtalkoholkonsum während des Zwei-Flaschen-Auswahlverfahrens nicht (Abb. S4). Dennoch zeigten sich nach Alkoholexzessen große individuelle Unterschiede in der Selbstverabreichung von Alkohol und der Sensibilität gegenüber Strafen (Abb. 2F). Während ungestrafter STAR-Phänotypisierungs-Selbstverabreichungssitzungen zeigten sowohl starke als auch zwanghafte Trinker einen höheren Alkoholkonsum und eine höhere operative Reaktion im Vergleich zu niedrigen Trinkern (Abb. 2G, H). Obwohl sich starke und zwanghafte Trinker im Selbstkonsumverhalten während reiner Alkoholsitzungen nicht unterschieden, reagierte der Alkoholkonsum bei zwanghaften Trinkern deutlich weniger empfindlich auf Bestrafung als bei niedrigen und starken Trinkern (Abb. 2I). Interessanterweise war der Einfluss der Bestrafung auf die Reaktion des Operanten unabhängig von der Einnahme und variierte je nach Phänotyp, da sowohl starke als auch zwanghafte Trinker während der Bestrafungssitzungen trotz stark unterschiedlichem Konsum hohe Reaktionsraten zeigten (Abb. 2I–J). Wichtig ist, dass phänotypische Verhaltensweisen weder mit Unterschieden im Gewicht der Probanden verbunden waren (Abb. S5), noch waren sie auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Chinin selbst zurückzuführen, da es keine Unterschiede in der Chininvermeidung gab, wenn sie in einem Geschmackspräferenztest außerhalb des Kontexts von Alkohol dargestellt wurden ( Abb. S6).

Diese Ergebnisse bestätigen, dass wiederholtes Trinken sehr unterschiedliche latente Verhaltensmerkmale offenbaren kann, selbst wenn Probanden ähnlichen Mengen Alkohol ausgesetzt sind. Tatsächlich verstärkten sich die begrenzten Unterschiede im Trinkverhalten, die bei den anfänglichen Tests beobachtet wurden, mit der Zeit und der Erfahrung und bildeten stark unterschiedliche Phänotypen, trotz gleichwertigem Alkoholkonsum während der Zwei-Flaschen-Wahl-Tests. Darüber hinaus verdeutlichen diese Daten, dass multivariate Bewertungen unterschiedliche Phänotypen aufdecken, die bei Verwendung eindimensionaler Messungen unentdeckt bleiben würden. Beispielsweise zeigen Vieltrinker, die durch Kovarianz zwischen zwei Merkmalen definiert sind, während bestrafter STAR-Phänotypisierungssitzungen eine erhöhte Reaktion des Operanten, obwohl sie einen geringen Konsum aufweisen (Abb. 2G – J). Die dissoziierbaren Messungen von Aufnahme und Reaktion stellen eine zusätzliche Achse des trinkbezogenen Verhaltens dar, anhand derer Probanden beurteilt werden können, und können eine diskrete Beurteilung appetitanregender und konsumatorischer Verhaltensprozesse ermöglichen, die während des Alkoholkonsums auftreten [64, 65].

Die bisher vorgestellten Verfahren und Analysen bilden eine Hochdurchsatzplattform für die quantitative Bewertung mehrerer klinisch relevanter Ergebnismaße, bestimmen die Entstehung phänotypischer Verhaltensweisen zwischen Probanden und im Zeitverlauf und können durch die Verbreitung empirischer Erkenntnisse in einem einfachen konzeptionellen Rahmen problemlos integriert werden mit translationaler und klinischer Literatur. Aus wissenschaftlicher und praktischer Sicht muss dieser Ansatz jedoch auch Funktionen bieten, die für Alkoholforscher mit vielfältigen experimentellen Fragestellungen und technischen Ansätzen attraktiv sind, damit das STAR-Framework den Zusammenhalt zwischen Teilbereichen erleichtert.

Die Integration moderner Neurotechnologien in Alkoholtrinkverfahren bei Nagetieren stellt eine ständige Herausforderung auf diesem Gebiet dar, da spezifische Aufgabenstrukturen, spezielle Hardware und zeitaufgelöste Verhaltensanzeigen erforderlich sind (23, 66, 67, 68). STAR wurde explizit entwickelt und optimiert, um diese Herausforderungen zu umgehen. Durch den Einsatz motorisierter Sipper zur Alkoholabgabe und zur zeitlich präzisen Leckerkennung können Techniken, die eine Anbindung und am Kopf montierte Hardware erfordern, wie z. B. Miniaturmikroskope oder Faserphotometrie, ohne Änderungen am Verfahren implementiert werden [43]. Darüber hinaus sind Reaktionen auf die aktiven und inaktiven Operanden, verstärkte Reaktionen und Alkoholkonsum aufgrund der Verwendung eines FR 10-Verstärkungsplans von Natur aus zeitlich beabstandet, was klare Vergleiche zeitaufgelöster neuronaler Messungen über mehrere Reize hinweg ermöglicht [23, 66] . Zeitreihen-Verhaltensdaten werden während aller Selbstverabreichungssitzungen aufgezeichnet und bieten eine Möglichkeit zur Anbindung an In-vivo-Aufzeichnungs- und Manipulationstechniken sowie zur Bewertung granularer Verhaltensweisen, die während des Trinkens auftreten, wie z. B. mikrostrukturelle Muster des Leckverhaltens (Abb. S7).

Während die STAR-Phänotypisierung nur eine volumetrische Messung des Alkoholkonsums erfordert, die als einzelne Messung pro Sitzung aufgezeichnet wird, bietet die Einbeziehung von Zeitreihenmessungen auch ein Mittel für eine umfassende Phänotypisierung. Beispielsweise können kumulative Aufzeichnungen operanter Antworten generiert werden, um Daten innerhalb der Sitzung zu visualisieren (Abb. 3A, B), die zusätzliche phänotypische Divergenzen aufdecken können, die bei groben Verhaltensanzeigen nicht beobachtet werden können. Tatsächlich zeigt die Zeitreihenanalyse der Reaktion und der Leckrate während der ersten Gelegenheit der Probanden, bis zur Vergiftung zu trinken, eine große Varianz zwischen und innerhalb des Phänotyps in den zeitlichen Verhaltensmustern (Tag 1 vor dem Essattacken, Abb. 3C), auch wenn die Varianz gering war und zu diesem Zeitpunkt wurden keine Gruppenunterschiede bei der gesamten Alkoholaufnahme und der Reaktion festgestellt (vgl. Abb. 2A–C).

Das genaue Timing von Verhaltensereignissen wird aufgezeichnet (Abtastung mit 1 kHz, Binning durch Grafik dargestellt), was eine Online-Schnittstelle mit Techniken zur Beobachtung und Manipulation neuronaler Aktivität oder mit Post-hoc-Analysepipelines ermöglicht, ohne dass die Aufgabenparameter geändert werden. Ein überlagertes Ereignis zeichnet die Antwortrate für aktive Reaktionen (blau, 10-s-Gruppierung), inaktive Reaktionen (grau, 10-s-Gruppierung) und Lecken (farbig nach Phänotyp des Probanden, 1-s-Gruppierung) für 15 Probanden während des Prä-Binge-Selbst auf -Verwaltungssitzung. Individuelle Unterschiede zwischen Probanden und Phänotypen können in den zeitlichen Reaktionsmustern beobachtet werden, selbst wenn die Gesamtantworten im Verlauf der Sitzung eine begrenzte Variabilität aufweisen. B Kumulative Aufzeichnungen aktiver (links) und inaktiver (rechts) Antworten für einzelne Probanden aus der ersten Selbstverabreichungssitzung vor dem Anfall. C Kumulierte Aufzeichnungen von Licks für einzelne Probanden aus derselben Sitzung. Wenigtrinker, n = 19; Vieltrinker, n = 5; Zwangstrinker, n = 17.

Die multivariate Phänotypisierung ist angeblich nützlich, muss jedoch noch empirisch getestet werden, ob die für STAR wesentlichen spezifischen Ergebnismaße, Alkoholkonsum allein und Alkoholkonsum angesichts einer Strafe, zusätzlich zu einem einzelnen Maß Erkenntnisse liefern. Alternativ können diese Maßnahmen auch einfach eine konzeptionell attraktive Redundanz darstellen. Um diese Möglichkeiten zu testen, behandelten wir eine Untergruppe von Tieren mit dem von der FDA zugelassenen AUD-Pharmakotherapeutikum Naltrexon, das den Alkoholkonsum bei einigen AUD-Patienten reduziert und in präklinischen Zwei-Flaschen-Wahltests zuverlässig den Alkoholkonsum senkt [33, 69]. Im Anschluss an die STAR-Phänotypisierungssitzungen wurde eine Untergruppe der Probanden in einer Reihe von drei Sitzungen zur Selbstverabreichung von Alkohol erneut auf Alkohol allein oder mit Bestrafung (0, 0,25, 0,5 mM Chininverfälschung, aufsteigende Reihenfolge) getestet. Diese Serie wurde zweimal getestet, einmal mit Naltrexon-Behandlung (1 mg/kg, ip) 30 Minuten vor der Verhaltenssitzung und einmal mit Kochsalzlösung (zufälliger Ausgleich der Behandlungsreihenfolge zwischen den Probanden).

Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit Naltrexon insgesamt bei allen getesteten Probanden den Alkoholkonsum während der ungestraften Selbstverabreichung im Vergleich zur Behandlung mit Kochsalzlösung verringerte (Abb. S8A). Im Gegensatz dazu kam es zwar zu einer gewissen Verringerung der Aufnahme während der Chinin-Bestrafungssitzungen, diese Effekte erreichten jedoch in keiner der beiden Bestrafungssitzungen statistische Signifikanz (Abb. S8B, C). Darüber hinaus wurde die Reaktion des Operanten auf den aktiven Nasenstich durch die Behandlung mit Naltrexon während der Bestrafungssitzungen mit Alkohol oder Chinin nicht verändert (Abb. S8D–F). Die Aufteilung der Daten nach Probandenphänotyp ergab, dass die durch Naltrexon verursachte Verringerung des ungestraften Alkoholkonsums durch zwanghafte Trinker verursacht wurde, während bei Niedrigtrinkern keine Wirkung von Naltrexon beobachtet wurde (Abb. S9A). Obwohl Naltrexon keine Auswirkungen auf die Einnahme während Bestrafungssitzungen oder auf die aktive Reaktion während irgendeiner Sitzungsart hatte, zeigten zwanghafte Trinker eine außergewöhnlich große Varianz zwischen den Probanden (Abb. S9B–F). Zusammengenommen stimmen diese Ergebnisse mit früheren Studien überein, wonach der Alkoholkonsum während der Selbstverabreichung im Allgemeinen eine umgekehrte Übersetzbarkeit aufweist. Wichtig ist, dass sie auch die Idee unterstützen, dass das STAR-Framework zusätzliche Informationen über dissoziierbare Achsen des trinkbezogenen Verhaltens liefert und dass die Berücksichtigung vielfältiger subjektinterner Maßnahmen zahlreiche Informationen liefert, die bei alleinigem Alkoholkonsum nicht überflüssig sind.

Als nächstes versuchten wir festzustellen, ob die STAR-Phänotypisierung sinnvolle Varianzen über Verhaltensbereiche hinweg erfasst, die für die Analyse selbst nicht explizit sind. Um dies zu untersuchen, konzentrierten wir uns auf den Einfluss alkoholbedingter Reize, die in Abwesenheit von Alkohol ein Suchverhalten auslösen können, einen Prozess, der vom anhaltenden Alkoholkonsum getrennt ist und von dem angenommen wird, dass er für die Auslösung von Rückfallereignissen von entscheidender Bedeutung ist [65, 70]. Da STAR ein operantes Verfahren verwendet, bei dem Tiere die kontextuellen und diskreten Hinweise im Zusammenhang mit Alkoholkonsum lernen, können die Auslöschungsraten operanter Signale sowie die Motivationsstärke alkoholbedingter Hinweise bei Bedarf für bestimmte experimentelle Fragen problemlos getestet werden. Zwei Wochen nach Abschluss der STAR-Phänotypisierungssitzungen wurden die Tiere in zwei täglichen Sitzungen eines Extinktionsvorgangs auf Extinktionsresistenz getestet, gefolgt von zwei konditionierten Verstärkungssitzungen, um die Motivationsstärke alkoholassoziierter Reize zu testen (Abb. 4A). Während der Auslöschungssitzungen hatten die Reaktionen keine Konsequenzen und das Sipper-Rohr wurde nie ausgefahren. In konditionierten Verstärkungssitzungen wurde die erste Reaktion auf der aktiven Seite verstärkt, woraufhin der Zeitplan für die restlichen Sitzungen auf FR 10 zurückkehrte. Die Reaktion wird durch eine 10-sekündige Verlängerung des Sippers verstärkt, allerdings ist der Sipper trocken/leer und es kann während der Sitzung kein Alkohol gewonnen werden, obwohl die übrigen experimentellen Parameter mit denen während der Phänotypisierungssitzungen identisch waren.

Eine experimentelle Zeitleiste. Aussterben: Nach Abschluss des STAR-Verfahrens und der Phänotypisierung (Abb. 1) werden die Tiere auf ihre Reaktion unter Aussterbebedingungen getestet, bei denen Reaktionen auf den zuvor aktiven Nasenstich keine Konsequenzen haben (Sitzung 1–2). Als nächstes werden Tiere getestet, um die konditionierte Verstärkung, die auf alkoholbedingte Signale reagiert, als Maß für die Alkoholsucht zu bestimmen (Sitzung 3–4). Konditionierte Verstärkung (Suche nach Alkohol): Während der konditionierten Verstärkung führt die erste Reaktion auf den aktiven Nasenstoß zur Präsentation des Trinkers und die Reaktion während der restlichen beiden Sitzungen wird durch einen Verstärkungsplan mit festem Verhältnis von 10 verstärkt. Nach der ersten Präsentation ist die Kontingenz identisch mit den Selbstverabreichungssitzungen vor dem Alkoholexzesse und der STAR-Phänotypisierung, mit der Ausnahme, dass der Trinkbecher keine Flüssigkeit enthält und daher die Reaktionsgeschwindigkeit als Maß für die Alkoholsucht in der Abwesenheit verwendet wird Zugang zu Alkohol. B Individuelle (links) und gemittelte (rechts) kumulative Aufzeichnungen der Reaktionen auf die zuvor aktiven Nose-Poke-Over-Extinction-Sitzungen (die beiden 60-minütigen Sitzungen wurden zu einer Aufzeichnung zusammengefasst, angezeigt durch die gepunktete Linie). C Antworten zu den zuvor aktiven und inaktiven Nasenstöcken während der beiden Aussterbesitzungen. Während der ersten Extinktionssitzung zeigten Vieltrinker im Vergleich zu Wenigtrinkern eine stärkere Reaktion auf den zuvor aktiven Nasenstich (Zwei-Wege-ANOVA, Nasenstich F(1, 12) = 18,26, p = 0,0011; Phänotyp, F(2, 12) = 2,067, p = 0,1693; Nose-Poke x Phänotyp F(2, 12) = 2,040, p = 0,1727). Während der zweiten Extinktionssitzung blieb ein Haupteffekt von Nose-Poke bestehen, es wurden jedoch keine Unterschiede zwischen den Phänotypen festgestellt (Zwei-Wege-ANOVA, Nose-Poke F(1, 12) = 19,08, p = 0,0009; Phänotyp, F(2, 12). ) = 1,695, p = 0,2248; Nose-Poke x Phänotyp F(2, 12) = 1,377, p = 0,2895). D Individuelle (links) und gemittelte (rechts) kumulative Aufzeichnungen der Reaktionen auf den aktiven Nose-Poke über konditionierte Verstärkungssitzungen (die beiden 60-minütigen Sitzungen wurden zu einer Aufzeichnung verkettet, angezeigt durch die gepunktete Linie). E Antworten auf die aktiven und inaktiven Nasenstöße während der beiden konditionierten Verstärkungssitzungen. Starke und zwanghafte Trinker reagierten während der beiden ersten Versuche stärker auf das aktive Nasenstechen im Vergleich zu wenig trinkenden Personen (Zwei-Wege-ANOVA, Nasenstechen F(1, 12) = 29,24, p = 0,0002; Phänotyp, F(2, 12) = 3,644, p = 0,0580; Nose-Poke x Phänotyp F(2, 12) = 4,118, p = 0,0435) und zweite (Zwei-Wege-ANOVA, Nose-Poke F(1, 12) = 45,97, p < 0,0001; Phänotyp , F(2, 12) = 4,080, p = 0,0445; Nose-Poke x Phänotyp F(2, 12) = 4,674, p = 0,0315) Sitzungen. Alle Vergleiche verwendeten den Tukey-Test: *p < 0,05; **p < 0,01. Wenigtrinker, n = 4; Vieltrinker, n = 5; Zwanghafte Trinker, n = 6. Fehlerbalken zeigen SEM an.

Während der Extinktion reagierten Vieltrinker während der ersten Extinktionssitzung stärker auf das zuvor aktive Operandum als Niedrigtrinker, jedoch nicht in der zweiten Extinktionssitzung (Abb. 4B, C), was darauf hindeutet, dass der Phänotyp der Starktrinker mit der Resistenz gegenüber dem Aussterben der Reaktion auf Alkohol verbunden ist . Während der konditionierten Verstärkung reagierten die Tiere robust, um Zugang zum alkoholbedingten Reiz zu erhalten, wobei einige Probanden im Verlauf der beiden 60-minütigen Sitzungen mehrere hundert Mal reagierten (Abb. 4D). Sowohl starke als auch zwanghafte Trinker zeigten in beiden Sitzungen eine stärkere Reaktion als diejenigen mit geringem Alkoholkonsum (Abb. 4E), was zeigt, dass die Zugehörigkeit zum Phänotyp „starker und zwanghafter Trinker“ ein erhöhtes alkoholbedingtes Verstärkungsverhalten vorhersagte, das bei fehlendem Alkoholzugang gemessen wurde. Zusammengenommen verdeutlichen diese Daten die vielfältigen Forschungsfragen, die im Rahmen des STAR-Rahmens behandelt werden können, und unterstreichen den Nutzen der STAR-Phänotypisierungsmethode zur Erfassung aussagekräftiger Phänotypen, die Varianz in verwandten Verhaltensbereichen vorhersagen.

Eine Schlüsselkomponente des STAR-Frameworks ist seine Modularität, die auf Gruppennormalisierung beruht, sodass die Phänotypisierung auf der Grundlage von Werten bestimmt wird, die als Prozentsatz des Gruppenmittelwerts normalisiert sind, der von Probanden abgeleitet wird, die unter identischen Versuchsbedingungen getestet wurden. Wie bei jeder Analyse individueller Unterschiede ist die Stichprobengröße ein wesentlicher Faktor für die Ergebnisse der Analyse, und die Gruppennormalisierung dürfte den potenziellen Einfluss der Probandenzahl weiter verstärken. Die Bestimmung der Stabilität der STAR-Phänotypisierung als Funktion der Probengröße ist daher von größter Bedeutung für ihre Nützlichkeit als gemeinsames Rahmenwerk, das in allen Labors implementiert werden kann. Zu diesem Zweck haben wir einen permutierten Resampling-Test implementiert, bei dem Stichproben unterschiedlicher Größe iterativ durch zufällige Unterabtastung des gesamten Datensatzes generiert wurden (Stichprobengrößen 2 bis 41 Probanden, jeweils 100 Iterationen). Jede Teilstichprobe wurde unabhängig analysiert, sodass die Gruppennormalisierung jedes Mal neu bestimmt wurde und die aus der Teilstichprobenanalyse abgeleiteten Phänotypzuordnungen dann mit denen aus dem vollständigen Datensatz verglichen wurden. Somit wurde durch Permutationstests die empirische Wahrscheinlichkeit einer Änderung der Phänotypzuordnung als Funktion der Stichprobengröße bestimmt (Ergänzungsvideo 1 und Abb. S10A). Wir zeigen, dass bei Stichprobengrößen von ≥ 12 Probanden die Phänotypzuordnung in unserem Datensatz sehr stabil wird (Abb. S10B). Als Best Practices für die laborübergreifende Implementierung der STAR-Phänotypisierung empfehlen wir eine standardmäßige Mindeststichprobengröße von mindestens 15 Probanden, die unter identischen Versuchsbedingungen getestet werden, bevor die STAR-Phänotypisierung durchgeführt wird. Diese Empfehlung soll als Ausgangspunkt dienen, nach dem genaue statistische Parameter auf die experimentelle Fragestellung und die beobachtete Variabilität zugeschnitten werden können.

Wie oben erläutert, besteht eine wichtige Empfehlung aus der Metaanalyse-Literatur zu präklinischen Modellen darin, den Schwerpunkt verstärkt auf Verhaltensendpunkte zu legen, bei denen die biologischen Grundlagen bei Tieren und Menschen erhalten geblieben sind. Dies ist natürlich ein umfassendes Ziel, das nicht in einem einzelnen Experiment angegangen werden kann und bei dem nicht erwartet werden kann, dass es eine einzelne binäre Lösung gibt. Dennoch ist es von größter Bedeutung, dieses Ziel voranzutreiben. Daher haben wir als nächstes versucht, die potenziellen neurobiologischen Marker zu untersuchen, die STAR-Phänotypen unterscheiden könnten, mit dem übergeordneten Ziel, eine Grundlage für die weitere Bewertung der Kongruenz mit den Faktoren zu schaffen, die individuelle Unterschiede im Trinkverhalten beim Menschen unterscheiden. Wir haben zuvor gezeigt, dass optogenetische Manipulationen von Neuronen des medialen präfrontalen Kortex (mPFC), die in den dorsalen periaquäduktalen Graubereich (dPAG) projizieren, eine bidirektionale Modulation des zwanghaften Trinkverhaltens bewirken [43]. Anschließend bewerteten zwei unabhängige Neuroimaging-Studien an menschlichen Probanden explizit A-priori-Hypothesen auf der Grundlage unserer Schlussfolgerungen und fanden höchst übereinstimmende Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass die kortikale Hirnstammaktivität ein Neuro-Biomarker für die Anfälligkeit für zwanghaftes Trinkverhalten ist [44, 45]. Daher konzentrierten wir unsere Bemühungen auf mPFC und dPAG, um diese bereichsübergreifende Untersuchung der biologischen Grundlagen AUD-relevanter Verhaltensweisen voranzutreiben [43,44,45, 71].

Um nach Neurobiomarkern zu suchen, die Unterschiede im Trinkverhalten verschiedener Tiere erklären könnten, verwendeten wir gekoppelte Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), um ein neurochemisches Screening nach dem STAR-Verfahren durchzuführen. 24 Stunden nach einer letzten Alkohol-Selbstverabreichung wurden die Tiere getötet, Proben von mPFC und dPAG zur Analyse gesammelt und die Konzentrationen von 23 Neurotransmittern, Vorläufern und Metaboliten für jede Region bei 15 Probanden mittels LC-MS bestimmt ( Tabelle S1–3). Wir bewerteten zunächst potenzielle Marker für erhöhten Alkoholkonsum oder bestrafungsresistenten Alkoholkonsum, indem wir die Konzentrationen jedes Analyten separat mit den beiden STAR-Phänotypisierungsmetriken (normalisierte Alkoholaufnahme oder Alkohol + Chinin) korrelierten (Abb. 5). Bei mPFC stellten wir fest, dass die Konzentrationen von 5-HT, seinem primären Metaboliten 5-HIAA und dem Dopamin-Metaboliten DOPAC alle positiv mit der alleinigen Einnahme von Alkohol korrelierten (Abb. 5B). Wir fanden keine signifikanten Beziehungen zwischen den mPFC-Werten aller 23 Analyten und den normalisierten Werten der Alkohol- und Chininaufnahme der Probanden, was darauf hindeutet, dass mPFC bei der Unterscheidung einer ausgeprägten Trinkgewohnheit eine größere Rolle spielen könnte als zwanghaftes Trinken. Im dPAG-Gewebe war der Alkoholkonsum mit höheren Konzentrationen von 5-HT und Dopamin und ihren Metaboliten sowie erhöhten Konzentrationen von GABA und Glutamat verbunden (Abb. 5C). Im Gegensatz zu mPFC stellten wir fest, dass die Konzentrationen anregender (Glutamat, Asparaginsäure) und hemmender (GABA) Sender und deren Vorläufer (Glutamin) positiv mit den Alkohol- und Chinin-Aufnahmewerten korrelierten (Abb. 5C, weitere Daten siehe Abb. S11). Visualisierung). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Jia und Kollegen überein [44], die darauf hindeuten, dass das erregende/hemmende Gleichgewicht in dPAG ein entscheidender Faktor für die AUD-Anfälligkeit sowie für Phänotypen innerhalb von AUD ist.

A Die Tiere wurden 24 Stunden nach einer letzten Selbstverabreichung von Alkohol getötet und Proben von mPFC und dPAG wurden für die Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) vorbereitet. In jeder Region wurden 23 Analyten quantifiziert und Korrelationen durchgeführt, um die Beziehung zwischen Analyt und Selbstverabreichung während der Sitzungen nach dem Test für reine Alkohol- und Alkohol+Chinin-Sitzungen zu bestimmen. B- und C-r-Werte für jede Korrelation werden durch Kreisgröße und Farbe angezeigt. Statistisch signifikante Korrelationen sind mit Sternchen gekennzeichnet. Die Konzentrationen für jeden Analyten nach Phänotyp finden Sie in den Ergänzungstabellen 1–3. B Bei mPFC gab es eine positive Korrelation zwischen Asparaginsäure, Cystein, 5-HIAAA, 5-HT und DOPAC und der Selbstverabreichung von Alkohol während der Sitzungen nach dem Test. Keine Analyten korrelierten mit der Aufnahme während der Alkohol- und Chinin-Sitzungen nach dem Test. C Bei dPAG gab es starke Korrelationen zwischen mehreren Analyten und der reinen Alkohol-Selbstverabreichung. Darüber hinaus korrelierten die Konzentrationen von Asparaginsäure, GABA, Glutamat und Glutamin positiv mit der Aufnahme von Alkohol und Chinin. Korrelationskoeffizient nach Spearman: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Wenigtrinker, n = 4; Vieltrinker, n = 5; Zwangstrinker, n = 6.

Für die Grundlagenforschung und die translationale Forschung ist es von entscheidender Bedeutung, dass Studien sowohl männliche als auch weibliche Probanden untersuchen [72, 73]. Dementsprechend wurden weibliche Mäuse im STAR-Rahmen unter Verwendung derselben Methodik getestet, die oben für die männlichen Probanden beschrieben wurde, um festzustellen, ob dieselben Parameter auch bei weiblichen Mäusen eine zuverlässige Beurteilung individueller Unterschiede in der Alkoholverstärkung ermöglichen. Unter Verwendung des gleichen Erfassungsverfahrens erlangten weibliche Probanden (Abb. S12) problemlos einen Operanten, der auf Alkohol reagierte (92 % erfüllten die Kriterien, Abb. S13A). Ähnlich wie bei männlichen Probanden unterschieden sich die Phänotypen nicht in den Tagen bis zum Erwerb oder dem gesamten Alkoholkonsum während des Erwerbs (Abb. S13C, D). Nach der Akquisition wurden weibliche Probanden unter identischen Bedingungen wie oben beschrieben getestet, wobei zunächst das Selbstverabreichungsverhalten bei der ersten Gelegenheit, bis zur Vergiftung zu trinken, beurteilt wurde und dann nach einem zweiwöchigen Komasaufen-Protokoll eine STAR-Phänotypisierung durchgeführt wurde (Abb. S14).

In Anlehnung an die Ergebnisse männlicher Mäuse fanden wir bei weiblichen Mäusen keine Unterschiede zwischen den Phänotypen beim Alkoholkonsum (Abb. S15B), aber zwanghafte Trinker zeigten während der Selbstverabreichungssitzungen vor dem Alkoholkonsum bei unverfälschtem Alkohol eine erhöhte Reaktion des Operanten auf Trinkgeldzugang (Abb. S15C). . Die Phänotypen unterschieden sich bei der Selbstverabreichung, wenn Alkohol durch Chininverfälschung bestraft wurde, wobei zwanghafte Trinker eine höhere Aufnahme aufwiesen als Menschen mit geringem Alkoholkonsum (Abb. S15D). Sowohl Zwangstrinker als auch Vieltrinker reagierten während der Chininverfälschungssitzungen häufiger als Wenigtrinker (Abb. S15E).

Bei weiblichen Mäusen unterschieden sich die Phänotypen während des Zwei-Flaschen-Auswahlverfahrens nicht in Bezug auf Alkoholkonsum oder Präferenz gegenüber Wasser (Abb. S16). Dennoch waren, wie bei männlichen Probanden, bei STAR-Phänotypisierungssitzungen, die nach Komasaufen durchgeführt wurden, große individuelle Unterschiede in der Selbstverabreichung von Alkohol und der Sensibilität gegenüber Bestrafung deutlich erkennbar (Abb. S15F). Während der STAR-Phänotypisierungs-Selbstverabreichungssitzungen zeigten sowohl starke als auch zwanghafte Trinker einen höheren Alkoholkonsum und eine höhere operative Reaktion im Vergleich zu niedrigen Trinkern (Abb. S15G, H). Obwohl sich starke und zwanghafte Trinker im Selbstkonsumverhalten während reiner Alkoholsitzungen nicht unterschieden, reagierte der Alkoholkonsum bei zwanghaften Trinkern deutlich weniger empfindlich auf Bestrafung als bei niedrigen und hohen Trinkgewohnheiten (Abb. S15I). Darüber hinaus zeigten zwanghafte Trinker bei Sitzungen mit Alkohol und Chinin eine stärkere operative Reaktion als arme Trinker (Abb. S15J). Wichtig ist, dass phänotypische Verhaltensweisen wie bei Männern nicht mit Unterschieden im Gewicht der Probanden verbunden waren (Abb. S17) und auch nicht auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Chinin selbst zurückzuführen waren, da es keine Unterschiede in der Chininvermeidung gab, wenn sie in einem Geschmackspräferenztest außerhalb der Studie dargestellt wurden Kontext von Alkohol (Abb. S18). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass STAR robuste Tests sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Probanden ermöglicht. Detaillierte Protokolle, Code und zugehörige Ressourcen zur Implementierung von STAR wurden frei verfügbar gemacht (https://github.com/Siciliano-Lab/STAR).

Die Entwicklung präklinischer Modelle und die Weiterentwicklung zu klinischen Endpunkten ist seit langem eine Stärke des Alkoholbereichs. Jahrzehntelange offene Debatten sowie Vorwärts- und Rückwärtsübersetzungen durch verschiedene Modellarten haben zu einer konsequenten Optimierung von Tiermodellen geführt, die letztendlich zu mehreren zugelassenen pharmakotherapeutischen Interventionen für AUD geführt hat (33, 35, 74, 75). Da sich die klinischen Ziele jedoch hin zu personalisierten Medikationsstrategien verlagern, besteht ein zunehmender Bedarf an präklinischen Modellen des Alkoholkonsums, die individuelle Unterschiede erfassen und multimodale Bewertungen spezifischer Verhaltensweisen innerhalb des AUD-Spektrums einbeziehen [52, 53]. Gleichzeitig haben Fortschritte in der Neurotechnologie zur Abfrage der Zellaktivität in vivo in Echtzeit die Verhaltensneurowissenschaften rasch verändert, sind jedoch häufig nicht mit etablierten AUD-Modellen kompatibel, was zu einer Divergenz der Methoden auf dem gesamten Gebiet führt (43, 76, 77). Um diese Probleme anzugehen, entwickeln wir hier einen Ansatz zur strukturierten Verfolgung der Alkoholverstärkung. Wir (1) bestätigen, dass die STAR-Phänotypisierung eine leicht übertragbare Methode zum Extrahieren aussagekräftiger Klassifizierungen aus der Längsdynamik über multimodale Verhaltensdomänen hinweg bietet, (2) demonstrieren die Modularität von STAR, um eine Reihe experimenteller Fragen flexibel zu verfolgen, einschließlich der Einbeziehung etablierter präklinischer Modelle, und ( 3) Identifizieren mehrerer potenzieller Biomarker für die Anfälligkeit für Alkoholkonsum durch neurochemisches Profiling von mPFC und dPAG.

Reinforcement Learning wird disziplinübergreifend weithin genutzt und verstanden, sodass Ergebnisse paradigmen- und speziesübergreifend ausgewertet werden können, einschließlich menschlicher Laborexperimente [78, 79]. Im STAR-Rahmen werden der willentliche Ethanolkonsum und das bestrafungsresistente Trinken in einer operanten Verstärkungsaufgabe bewertet. Die Messung des Alkoholkonsums und der Bestrafungsresistenz unter operanten Verstärkungsbedingungen und der anschließende Phänotypisierungsansatz sind die beiden Kernelemente von STAR; Eine beliebige Anzahl experimenteller Fragestellungen kann flexibel beantwortet werden, indem zusätzliche Tests in das operante Rahmenwerk integriert werden (z. B. konditionierte Verstärkung) oder mit anderen Tests kombiniert werden (z. B. Zwei-Flaschen-Auswahl). Die Phänotypisierungsanalyse selbst ist die einzige Komponente, die völlig starr ist. Wir empfehlen, die Berechnung identisch durchzuführen, um einen Vergleich zwischen Studien zu ermöglichen (siehe Methoden und Online-Repository).

STAR erfüllt mehrere Kriterien, die fachübergreifend als vorteilhafte Merkmale für präklinische Modelle identifiziert wurden. Wir zeigen, dass Unterschiede im Alkoholkonsum und beim Trinken trotz Bestrafung drei Phänotypen definieren, die wir als „Niedrigtrinker“, „Hochtrinker“ und „Zwangstrinker“ bezeichnen. Wichtig ist, dass dieser relativ einfache Ansatz die Varianz zwischen AUD-relevanten Ergebnismaßen erfasst, die nicht in die Phänotypisierungsanalyse einbezogen wurden. Beispielsweise unterscheiden sich diese Phänotypen auch in den operanten Reaktionsraten während der Selbstverabreichung von Alkohol, der Extinktionsresistenz und der Alkoholsucht. Darüber hinaus scheinen diese Messungen Ausdruck dissoziierbarer Prozesse innerhalb der Alkoholverstärkung zu sein, die sich je nach Phänotyp unterschiedlich manifestieren. Wie oben erwähnt, ermöglicht diese Strukturierung die Verwendung desselben Rahmens für eine Reihe von Anwendungen und bietet insbesondere die Flexibilität, die für grundlegende wissenschaftliche Fragen erforderlich ist, wobei der formale Rahmen für präklinische translationale Pipelines hilfreich ist.

Der Extinktions- und konditionierte Verstärkungstest ist zwar kein erforderlicher Bestandteil von STAR, liefert aber eine zuverlässige Aussage über das Alkoholsuchverhalten. Die Reaktion auf drogenbedingte Reize wird in der Literatur zu Stimulanzien häufig als Maß für das Verlangen nach Drogen verwendet, Protokolle für alkoholbedingte Reaktionen sind jedoch nicht so gut etabliert, insbesondere bei Mäusen. Interessanterweise sehen wir, dass die meisten Probanden in der zweiten konditionierten Verstärkungssitzung häufiger reagieren. Wir spekulieren, dass dieser Effekt mit dem „Inkubations“-Phänomen vergleichbar sein könnte, das in der präklinischen Kokain-Literatur ausführlich untersucht wurde, wobei die Reaktion auf drogenbedingte Reize im Verlauf der Abstinenz zeitabhängig zunimmt [80, 81]. In diesem Fall scheint die erhöhte Reaktion als Funktion der Exposition gegenüber dem alkoholbedingten Verstärker aufzutreten, was möglicherweise eher mit der klinischen Literatur vergleichbar ist als ein rein zeitabhängiges Phänomen [82, 83]. Wichtig ist, dass dieser Effekt unabhängig von den zugrunde liegenden psychologischen Treibern durch die Präsentation des konditionierten Verstärkers vorangetrieben wird, da die Reaktion unter Extinktionsbedingungen im Verlauf von zwei Sitzungen abnahm.

Wir nutzen diese Aufgabe, um einzelne Phänotypen, die im Laufe der Zeit entstehen, zu analysieren und potenzielle Biomarker für diese phänotypische Divergenz zu identifizieren. Mithilfe von LC-MS zur Beurteilung einer Reihe von Analyten in mPFC und dPAG zeigen wir, dass Dopamin- und 5-HT-bezogene Analyte sowohl in mPFC als auch in dPAG positiv mit der Aufnahme während der Selbstverabreichung von Alkohol korrelierten, dass jedoch keine Korrelation bestand zwischen den Konzentrationen eines der 23 untersuchten Moleküle und dem Alkoholkonsum während bestrafter Sitzungen. Im Gegensatz dazu korrelierten erregende und hemmende Botenstoffe im dPAG positiv mit zwanghaftem Trinken. Diese Daten legen nahe, dass die Monoaminaktivität ein weit verbreiteter Biomarker für hohen Alkoholkonsum sein könnte, was mit mehreren klinischen Studien übereinstimmt, die eine erhöhte Dopamin- und 5-HT-Aktivität bei starken Trinkern belegen, die in mehreren Gehirnregionen und im zirkulierenden Liquor beobachtet werden kann. Darüber hinaus tragen sie zu den zunehmenden Beweisen bei, dass die dPAG-Aktivität ein Biomarker für die Anfälligkeit für zwanghaftes Trinkverhalten ist und möglicherweise ein neurobiologisches Substrat darstellt, das zwanghafte von übermäßig trinkenden Phänotypen unterscheidet [43, 44, 45, 84].

Obwohl wir in parallelen Experimenten die Verwendung von STAR sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen nachgewiesen haben, haben wir keine direkte Analyse der Auswirkung des Geschlechts auf Ergebnismaße veröffentlicht, da wir der Meinung sind, dass eine klare Interpretation möglicher sexueller Dimorphismen zusätzliche Experimente erfordert, die noch im Gange sind . Qualitativ gesehen zeigten weibliche Mäuse während der Selbstverabreichungssitzungen im Allgemeinen einen deutlich geringeren Alkoholkonsum als männliche (vgl. Abb. 1 und Abb. S14), was den Schluss zulässt, dass männliche Mäuse daher anfälliger für Alkoholkonsum sind als weibliche. Bei der Wahl von zwei Flaschen sind diese Unterschiede jedoch bei denselben Tieren nicht ohne weiteres erkennbar (vgl. Abb. S4A und S16A). Dies erinnert an neuere Erkenntnisse sowohl in der Kokain- als auch in der Opioidliteratur, die zeigen, dass trotz der seit langem vertretenen Ansicht, dass Frauen sich häufiger selbst verabreichen, dieser Zusammenhang aufgehoben oder sogar umgekehrt wird, wenn Anstrengungen erforderlich sind, um an die Droge zu gelangen, oder wenn sie als solche präsentiert werden eine diskrete Wahl zwischen Verstärkern [85,86,87]. Wir und andere haben kürzlich gefordert, bei der Interpretation von Daten zur Selbstverabreichung von Drogen und Alkohol eine stärkere Betonung der Wechselwirkungen zwischen Geschlecht und Umwelt anstelle von Behauptungen über sexuellen Dimorphismus zu fordern [88,89,90]. STAR bietet eine Plattform für künftige Untersuchungen an weiblichen Probanden sowie einen quantitativen Rahmen für die Analyse von Geschlecht x Zeitplan x Umweltinteraktionen bei der spezifischen Untersuchung von Geschlechtsunterschieden. Die vorgestellten Experimente waren nicht darauf ausgelegt, potenzielle geschlechtsspezifische Auswirkungen zu analysieren, und wir warnen davor, sie als solche zu interpretieren. Ziel dieser parallelen Experimente war vielmehr, die Verwendung von STAR für die Untersuchung sowohl männlicher als auch weiblicher Probanden zu etablieren. Die Richtigkeit dieses Ansatzes wird durch die Tatsache gestützt, dass die Phänotypen in beiden Fällen klar getrennt werden können und dass die Phänotypzugehörigkeit auf Verhaltensvariablen abgebildet wird, die nicht in der Phänotypanalyse selbst enthalten sind (z. B. Hebeldrücken), wobei ein bemerkenswerter Grad an Ähnlichkeit zwischen ihnen besteht die Geschlechter.

Gemeinsam schaffen wir einen neuartigen Rahmen, um grundlegende Fragen zur biologischen Aktivität von Alkohol zu beantworten, und stellen dieses Protokoll frei zur Verfügung, in der Hoffnung, dass es den Zusammenhalt zwischen Teilbereichen erleichtern und so zu einem besseren Verständnis von AUD führen kann (siehe Methoden für Ressourcen-Repository). Wir schlagen STAR als neues flexibles Modell für die Untersuchung der Entwicklung von AUD und anderen SUDs mit Zeit und Erfahrung bei Männern und Frauen vor. Die Möglichkeit, eine einzige Aufgabe zu haben, die individuelle Unterschiede in der Entwicklung von AUD verfolgt, ist immer noch von hoher Relevanz. Die Flexibilität und die Fähigkeit von STAR, sich leicht in bestehende Technologien und Tools zu integrieren, machen es zu einem starken Modell für die Untersuchung der individuellen Entwicklung von erhöhtem Alkoholkonsum und -zwang aus Verhaltens-, Kreis- und Bevölkerungsperspektive.

Für alle Experimente wurden männliche und weibliche C57BL/6 J-Mäuse verwendet (Jackson Laboratory). Die Tiere kamen im Alter von 8 Wochen an und durften sich mindestens eine Woche lang an die Einrichtung gewöhnen, bevor Tests durchgeführt wurden. Die Tiere wurden in Fünfergruppen in einem umgekehrten 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit Wasserzugang nach Belieben gehalten. Futter (Picolab 5L0D, LabDiet) wurde täglich leicht über dem Kalorienbedarf verabreicht, so dass im Verlauf der Experimente ein gesundes Erwachsenengewicht aufrechterhalten wurde (Männchen: 2,9–3 g/Tier/Tag, Weibchen: 2,6–2,7 g/Tier/Tag). , entsprechend etwa 8,7 bzw. 7,5 kcalME/Tag für männliche und weibliche Probanden) [91, 92]. Alle Experimente mit Tieren entsprachen den NIH-Richtlinien und wurden vom Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

Alle Konditionierungsexperimente wurden in einer operanten Konditionierungskammer (Skinner Box, Med Associates) durchgeführt. Zwei beleuchtete Nose-Poke-Ports wurden auf beiden Seiten eines Belohnungsports mit einem einziehbaren Trinkschlauch (Med Associates, ENV-352AW) positioniert. Nasenstiche wurden durch Infrarotstrahlunterbrechungen und Lecken durch ein Widerstandsleckmesser (Med Associates, ENV-250C) erkannt. Alle Sitzungen wurden während des Dunkelzyklus der Tiere im Dunkeln durchgeführt und die Mäuse wurden kontinuierlich über Infrarotkameras über dem Kopf (Security Camera Warehouse) überwacht.

Die Probanden wurden einmal täglich in einstündigen Sitzungen getestet. Sofern nicht anders angegeben, wurde durchgehend 15 % Ethanol (v/v) verwendet, das aus 95 % Stammlösung hergestellt und in hochreinem Wasser verdünnt wurde. Die Mäuse wurden am Ende jeder täglichen Sitzung gewogen und gefüttert, nachdem alle Tiere ihr Experiment für den Tag abgeschlossen hatten. Nasenstöße wurden beleuchtet, um den Beginn jeder Sitzung zu signalisieren (mit Ausnahme des Magazintrainings), und die Reaktion auf den inaktiven Nasenstoß hatte durchgehend keine programmierte Konsequenz (die aktive Seite war bei allen Tieren ausgeglichen).

Während der Erfassung wurden die Sitzungen beendet, wenn das Tier 100 Lecks erreicht hatte oder nach einer Stunde, je nachdem, was zuerst eintrat. Die Akquisition erfolgte in drei Phasen, die im Folgenden beschrieben werden. Wenn die Tiere in einer Phase in drei aufeinanderfolgenden Sitzungen die Kriterien nicht erfüllten, wurden sie in die vorherige Phase zurückgebracht, bis die Kriterien für ein Weiterkommen erneut erfüllt waren. Wenn ein Proband insgesamt dreimal in eine vorherige Phase zurückgekehrt war, wurde er aus dem Experiment entfernt (siehe Abbildungen S2 und S12 für Akquisitions-/Abnutzungsraten).

Die Tiere wurden in die operante Konditionierungskammer gelegt, wobei der Saugschlauch ständig ausgefahren war. Sobald die 100-Lick-Grenze erreicht war, wurde der Sipper zurückgezogen und die Versuchsperson wurde am nächsten Tag zur operanten Konditionierungserfassung überführt.

Kriterium 1: Die Reaktion auf den aktiven Nasenstoß wurde durch die Verlängerung des Sippers für 30 Sekunden im Rahmen eines FR 1-Zeitplans verstärkt. Die Tiere wurden auf das zweite Kriterium umgestellt, sobald die 100-Leck-Grenze an zwei aufeinanderfolgenden Tagen erreicht wurde.

Kriterium 2: Die Reaktionsfähigkeit wurde im Rahmen eines FR 1-Zeitplans weiter verstärkt, die Zugriffsdauer wurde jedoch auf 10 s verkürzt. Die Tiere wurden in die Phase der operanten Diskriminierung überführt, sobald an zwei aufeinanderfolgenden Tagen die 100-Lick-Grenze erreicht war.

Die Reaktionsanforderung wurde auf einen FR 5-Zeitplan für einen 10-s-Zugriff erhöht. Tiere galten als akquiriert, sobald sie eine Antwortrate von ≥ 70 % auf der „Aktiv“-Seite (Aktiv/[Aktiv+Inaktive Reaktionen]) zeigten und in zwei aufeinanderfolgenden Sitzungen die Obergrenze von 100 Lecks erreichten.

Am Tag nach Abschluss der Akquise liefen die Tiere eine Stunde pro Tag (keine Leckkappe) und die Sitzungen verliefen unabhängig von der Leistung in einer festen Reihenfolge. Die Reaktion wurde im Rahmen eines FR 10-Zeitplans durch die durchgehende Präsentation des Sippers für 10 Sekunden verstärkt.

An den Tagen 1–3 enthielt der Trinkbecher 15 % Ethanol (v/v). An den Tagen 4–7 wurde Ethanol mit Chinin in steigenden Konzentrationen für jede Sitzung verfälscht (250, 500, 750 und 1000 µM in 15 % EtOH).

Am Tag nach Abschluss der Pre-Binge-Epoche erhielten die Tiere Zugang zu Alkohol in einem Zwei-Flaschen-Auswahlverfahren, von dem bekannt ist, dass es zuverlässig zu einem hohen Alkoholkonsum führt [43, 93]. Die Tiere wurden einzeln in einen sauberen Heimkäfig gesetzt und durften sich 30 Minuten lang akklimatisieren, bevor zwei Flaschen, die entweder 15 % Ethanol (v/v) oder Wasser enthielten, auf die Käfigoberseite gestellt wurden, wobei der Auslauf in den Käfig hineinragte (Seitenausgleich über Tage, Flaschen nach 2 Stunden in den Dunkelzyklus einschalten). An den ersten vier Tagen hatten die Tiere zwei Stunden Zugang und am fünften Tag hatten die Tiere vier Stunden Zugang. Die folgenden zwei Tage waren Abstinenztage, an denen die Tiere in ihren ursprünglichen Heimkäfigen blieben. Dieser einwöchige Zyklus (vier Tage 2-stündiger Zugang, ein Tag 4-stündiger Zugang und zwei Tage Abstinenz) wurde wiederholt (insgesamt 14 Tage).

Die STAR-Phänotypisierungssitzungen begannen am Tag nach dem letzten Abstinenztag der Binge-Epoche. Das Experiment war in Struktur und Parametern identisch mit der Epoche vor dem Binge.

Um die STAR-Phänotypisierung durchzuführen, werden zwei Werte für jedes Tier berechnet und als Prozent des Probenmittelwerts ausgedrückt: (1) durchschnittlicher g/kg-Verzehr des Probanden über 3 reine Alkoholsitzungen [Alkoholaufnahme = (mittlerer Probandensitzung 1–3 (g/ kg)/Mittelwert aller Probanden Tag 1–3 (g/kg))*100] und (2) durchschnittliche g/kg der Probanden über 4 Alkohol+Chinin-Sitzungen [Alkohol+Chininaufnahme = (mittlere Probandensitzung 4–7 ( g/kg)/Mittelwert aller Probanden Tag 4–7 (g/kg)*100]. Basierend auf den berechneten Werten für Alkoholkonsum und Alkohol+Chininkonsum werden die Tiere einem von drei Phänotypen zugeordnet. Tiere mit unterdurchschnittlichen Werten sowohl für Alkohol als auch für Alkohol+Chinin gelten als „Geringe Trinker“ [Alkohol <100 % & Alkohol+Chinin <100 %]; diejenigen mit Werten über dem durchschnittlichen Alkoholkonsum, aber unter dem durchschnittlichen Alkohol+Chinin-Wert wurden als „starke Trinker“ eingestuft [Alkohol >100 % und Alkohol+Chinin <100 %]; Tiere mit überdurchschnittlichen Alkohol- und Chininwerten galten als „zwanghafte Trinker“ [Alkohol + Chinin > 100 %]. Zur Visualisierung empfehlen wir, die Werte für alle Tiere als Streudiagramm darzustellen, wobei x = [Alkohol+Chininwerte] und y = [Alkoholwerte nur].

Während des Aussterbens wurden die Trinkschläuche mit Alkohol gefüllt und in den ausziehbaren Trinksauger gesteckt, genau wie bei früheren Sitzungen, aber die Nasenlöcher wurden auf beiden Seiten nicht verstärkt und der Trinksauger blieb die ganze Zeit über eingefahren. Die Tiere wurden unter diesen Bedingungen in zwei aufeinanderfolgenden täglichen einstündigen Sitzungen getestet, gefolgt von zwei Tagen konditionierter Verstärkungstests. Während der konditionierten Verstärkung wurden die Sipper-Schläuche leer/trocken gelassen, aber wie üblich auf dem versenkbaren Anschluss platziert. Der erste Nasenstich auf der aktiven Seite führte dazu, dass der trockene Sipper 10 Sekunden lang präsentiert wurde. Nach der ersten Präsentation wurde die Reaktionsanforderung für den 10-sekündigen Zugang zum Trockensauger für den Rest der Sitzung auf FR 10 angehoben.

Nachdem alle Experimente abgeschlossen waren, führte eine Untergruppe der Tiere einen letzten Tag der Selbstverabreichung von Alkohol durch (FR 10 → 10 s Trinkgeldzugang, 1-stündige Sitzungen). Insgesamt wurden die Tiere 24 Stunden nach der letzten Selbstverabreichung getötet, die Gehirne eingefroren und später auf einem Kryostat (Leica) in 200-Mikrometer-Scheiben geschnitten. Gewebestanzen (500 Mikrometer Durchmesser) wurden verwendet, um Proben von mPFC und dPAG aus den Schnitten zu gewinnen, die dann bis kurz vor der Analyse bei -80 °C gelagert wurden. Kurz gesagt, Gewebestanzen wurden homogenisiert, 23 interessierende Analyten wurden gleichzeitig aus jeder Probe mittels LC/MS quantifiziert und die Analytkonzentrationen wurden auf den Gesamtproteingehalt der Probe normalisiert (Einzelheiten siehe ergänzende Methoden).

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism (V9) durchgeführt. Vergleiche zwischen drei oder mehr Variablen wurden mithilfe von einfaktoriellen ANOVAs oder zweifaktoriellen ANOVAs durchgeführt (gefolgt vom Tukey-Test, wenn geplante Vergleiche durchgeführt oder Wechselwirkungen festgestellt wurden). P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Programme zur Steuerung von Operantenboxen sowie detaillierte Standardarbeitsanweisungen, die so gestaltet sind, dass sie auch Forschern zugänglich sind, die möglicherweise nicht über umfassende Erfahrung mit der Konditionierung von Operanten verfügen, wurden zur Verfügung gestellt: https://github.com/Siciliano-Lab/STAR.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R00 DA04510 (NIDA), R01 AA030115 (NIAAA), U01 AA029971 (NIAAA), den Alkermes Pathways Research Award, die Brain Research Foundation und die Whitehall Foundation (CAS) unterstützt. PRM wird durch ein NIH-Stipendium (F31 AA029626) unterstützt.

Abteilung für Pharmakologie, Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt Center for Addiction Research, Vanderbilt University, Nashville, TN, 37232, USA

Alex R. Brown, Hannah E. Branthwaite, Zahra Z. Farahbakhsh, Snigdha Mukerjee, Patrick R. Melugin, Keaton Song und Cody A. Siciliano

Abteilung für Neurobiologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Habiba Noamany

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ARB und CAS haben das Projekt gemeinsam konzipiert. ARB, CAS, ZZF haben die Experimente entworfen. ARB, HEB, ZZF, SM, PRM und KS sammelten Daten. CAS und HN entwickelten MATLAB-Analysecode. ARB, ZZF, CAS führten eine Analyse durch. ARB und CAS erstellten die Zahlen und verfassten das Papier.

Korrespondenz mit Cody A. Siciliano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Brown, AR, Branthwaite, HE, Farahbakhsh, ZZ et al. Strukturierte Verfolgung der Alkoholverstärkung (STAR) für die grundlegende und translationale Alkoholforschung. Mol Psychiatry 28, 1585–1598 (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-01994-4

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Eingegangen: 5. Januar 2022

Überarbeitet: 26. Januar 2023

Angenommen: 07. Februar 2023

Veröffentlicht: 27. Februar 2023

Ausgabedatum: April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01994-4

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