Die Cholesterinbiosynthese moduliert die Differenzierung in kranialen Neuralleistenzellen der Maus

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7073 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Craniale Neuralleistenzellen (cNCC) sind eine multipotente embryonale Zellpopulation, die eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen hervorbringt. Diese Zellen sind besonders anfällig für externe Stoffwechselstressoren, wie der Zusammenhang zwischen mütterlicher Hyperglykämie und angeborenen Fehlbildungen zeigt. Wir waren daran interessiert, die Wirkung verschiedener Glukose- und Pyruvatkonzentrationen auf den cNCC-Metabolismus, die Migration und die Differenzierung mithilfe eines etablierten murinen Neuralleistenzellmodells (O9-1) zu untersuchen. Wir beobachteten unerwartet ein Muster der Genexpression, das auf eine Induktion der Cholesterinbiosynthese unter Glukosemangelbedingungen in O9-1-Zellen hindeutet. Wir haben außerdem gezeigt, dass die Behandlung mit zwei verschiedenen Cholesterinsynthesehemmern die Zellmigration und -differenzierung beeinträchtigt, die Chondrogenese hemmt und gleichzeitig die Differenzierung der glatten Muskelzellen verbessert. Da die angeborene Arhinie (fehlende äußere Nase), eine durch Mutationen in SMCHD1 verursachte Fehlbildung, teilweise einen Defekt in cNCC darzustellen scheint, waren wir auch daran interessiert, die Auswirkungen der Verfügbarkeit von Glukose und Cholesterin auf die Smchd1-Expression in O9-1-Zellen zu untersuchen . Die Smchd1-Expression wurde unter Bedingungen mit hohem Glukosegehalt induziert, wohingegen Cholesterinsyntheseinhibitoren die Smchd1-Expression während der Chondrogenese verringerten. Diese Daten verdeutlichen eine neuartige Rolle der Cholesterinbiosynthese in der cNCC-Physiologie und zeigen, dass die menschliche phänotypische Variabilität bei SMCHD1-Mutationsträgern teilweise mit der Empfindlichkeit von SMCHD1 gegenüber Glukose- oder Cholesterindosen während der Entwicklung zusammenhängen könnte.

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine vorübergehende embryonale Zellpopulation, die aus dem Ektoderm stammt und eine Vielzahl von Zelltypen hervorbringt. Während der Embryonalentwicklung durchqueren migrierende NCCs verschiedene Umgebungen mit einzigartigen Nährstoffen und einer lokalisierten Aktivierung von Enzymen, die sich auf ihre genetische Programmierung und Physiologie auswirken können1. Studien, die die Auswirkungen von Störungen der Substratverfügbarkeit untersuchen, zeigen, dass die räumlich-zeitliche Regulierung der Entwicklung teilweise durch Veränderungen im Stoffwechsel gesteuert wird2. Stoffwechselveränderungen im NCC sind zeitlich mit kritischen Schritten der NCC-Ontogenese wie Proliferation, Migration und Differenzierung verbunden und können diese tatsächlich stimulieren3. Darüber hinaus scheinen NCC besonders anfällig für externe Stoffwechselstressoren zu sein, wobei Hyperglykämie ein Paradebeispiel ist. Schwangerschaftsdiabetes ist mit einem höheren Risiko angeborener Fehlbildungen verbunden, die Gewebe und Organe betreffen, die aus NCC stammen (z. B. Herz-Kreislauf-, Skelett- und Zentralnervensystem), was darauf hindeutet, dass mütterliche Hyperglykämie für NCC hochtoxisch ist4,5,6,7. Tatsächlich zeigten frühe In-vitro-Studien, dass Kulturbedingungen mit hohem Glukosegehalt die Proliferation und Migration von cNCC bei Ratten aufgrund der Überproduktion reaktiver Sauerstoffspezies hemmen8. Neuere Arbeiten am Küken haben außerdem gezeigt, dass die Exposition gegenüber hohem Glukosegehalt die Apoptose und die ERK-vermittelte Autophagie bei der Entwicklung von cNCC9 hochreguliert und die Differenzierung embryonaler Stammzellen in eine neuronale Linie unterdrückt10. Es liegen jedoch keine Studien vor, um festzustellen, wie sich die Nährstoffverfügbarkeit auf die NCC-Physiologie auswirkt, und zwar unter Verwendung der O9-1-Zelllinie, einer multipotenten Linie, die aus embryonalen NCCs der Maus stammt11.

Defekte in der Ontogenese, Migration und/oder Differenzierung von NCC führen zu einer Reihe von Erkrankungen, die als Neurokristopathien bezeichnet werden. Das Bosma-Arhinia-Mikrophthalmie-Syndrom (BAMS) ist eine äußerst seltene, schwere angeborene Fehlbildung, die offenbar einen primären Defekt des kranialen NCC12, der kranialen Plakodenzellen13 oder ihrer Interaktion widerspiegelt. BAMS besteht aus der klinischen Trias Arhinie (fehlende Nase), Augenfehlern und Hypogonadismus14 und wird durch Mutationen im Gen „Structural Maintenance of Chromosomes Flexible Hinge Domain-Containing 1“ (SMCHD1)15,16 verursacht. Das Vorhandensein unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität in Multiplex-Familien lässt jedoch darauf schließen, dass andere in utero Faktoren die Expression oder Funktion von SMCHD1 beeinflussen können. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Nährstoffverfügbarkeit ein solcher Faktor sein könnte. Gestationsdiabetes wurde bei BAMS-Schwangerschaften nicht gemeldet, allerdings wird BAMS wahrscheinlich nicht ausreichend gemeldet (< 100 gemeldete Fälle im letzten Jahrhundert15). Die Richtlinien für die Diagnose von Schwangerschaftsdiabetes variieren von Land zu Land und sind im Laufe der Zeit strenger geworden, und das ist in letzter Zeit auch der Fall Es wurde erkannt, dass mütterliche Hyperglykämie linear mit dem perinatalen Risiko verbunden ist, ohne dass es einen offensichtlichen Schwellenwert gibt17. Daher untersuchten wir mithilfe des O9-1-Modellsystems auch die Auswirkung der Nährstoffverfügbarkeit auf die Smchd1-Expression.

Wir stellten die Hypothese auf, dass unterschiedliche Stoffwechselbedingungen die Physiologie des cNCC beeinflussen würden. Wir haben die Wirkung von 4 Kulturbedingungen untersucht: hohe Glukose (HG = 25 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), Kontrollglukose (CG = 5,55 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), keine Glukose (NG = 0 mM Glukose, 1 mM Pyruvat). und keine Glucose mit 2 × Pyruvat (NG2P = 0 mM Glucose, 2 mM Pyruvat). Während Zellkulturprotokolle häufig HG-Bedingungen nutzen, um die Proliferation zu maximieren, wurde die CG-Bedingung ausgewählt, um die Physiologie des sich entwickelnden Embryos am besten darzustellen18. Die NG-Bedingung wurde gewählt, um zu bestimmen, ob cNCC alternative Stoffwechselsubstrate wie Pyruvat verwenden könnte; Pyruvat war von besonderem Interesse, da es sich an der Schnittstelle mehrerer Wege im Kohlenstoffstoffwechsel befindet und eine Rolle bei der Aktivierung des embryonalen Genoms19 und der NCC-Physiologie3,20,21 spielte.

Um zu bestimmen, wie sich unterschiedliche Glukosebedingungen (HG, CG, NG, NG2P) auf die Genexpression im Maus-cNCC auswirken, wurde eine gewichtete Genkorrelationsnetzwerkanalyse (WGCNA) zur Interpretation der RNA-Seq-Daten eingesetzt. WGCNA konstruiert Gen-Koexpressionsnetzwerke, indem es Korrelationsmuster zwischen Genen in verschiedenen Proben berücksichtigt22. Hierarchisches Clustering wird dann verwendet, um Module oder Netzwerke von Genen mit stark korrelierter Genexpression zu identifizieren. Diese Module können dann mit anderen Merkmalen (hier der Glukosekonzentration) in Beziehung gesetzt und zur funktionellen Anreicherung abgefragt werden. Die Auswahl der interessierenden Module erfolgt entweder auf der Grundlage der mittleren Genbedeutung, der Modulzugehörigkeit (Genkonnektivität innerhalb eines Moduls), der Beziehung zu einem Merkmal oder biologischen Signalwegen. Um die Module von Interesse auszuwählen, haben wir zunächst die Stärke der Modulmitgliedschaft berücksichtigt (Konnektivität > 0,6). Da unser Versuchsaufbau einen Gradienten der Glukosekonzentrationen beinhaltete, entschieden wir uns dann, die beiden Module zu untersuchen, bei denen es auch einen linearen Gradienten in der Expressionsänderung von HG über CG zu NG zu NG2P gab. Es wurden 16 Module koexprimierter Gene unter verschiedenen Glukosebedingungen identifiziert. Im türkisfarbenen Modul nahm die Genexpression über alle Bedingungen hinweg ab, während im blauen Modul die Genexpression über alle Bedingungen hinweg zunahm (Abb. 1A, B, Ergänzungstabelle S1). Eine Überanreicherungsanalyse des türkisfarbenen Modells ergab Pfade, die mit dem Zellzyklus und der DNA-Reparatur verbunden sind (ergänzende Abbildung S1), wohingegen die Analyse des blauen Moduls unerwartet Cholesterinbiosynthese, Sphingolipid und Glykosphingolipid-Metabolismus ergab (Abb. 1C, ergänzende Abbildung S1). Glukose und von Glukose abgeleitete Metaboliten liefern Rohstoffe für die Cholesterinsynthese und regulieren biosynthetische Enzyme und Aufnahme von Cholesterin23. Es ist daher zu erwarten, dass ein Glukosemangel die Cholesterinbiosynthese herunterreguliert; Allerdings zeigten Mitglieder des Cholesterin-Biosynthesewegs, darunter Hmgcr, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Cholesterinsynthese, und Hmgcs1, das die Produktion von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA)24,25 katalysiert, eine erhöhte Expression unter NG- und NG2P-Bedingungen im Vergleich zu HG (Abb. 1D). Das Emopamil-Bindungsprotein (Ebp), das im Endstadium der Cholesterinbiosynthese eine Schlüsselrolle spielt, war unter CG- vs. HG-Bedingungen ebenfalls hochreguliert (Abb. 1D). Als nächstes haben wir den freien Cholesterinspiegel, den veresterten Cholesterinspiegel und den Gesamtcholesterinspiegel (dh die Summe aus freiem und verestertem Cholesterin) unter den verschiedenen Glukosekulturbedingungen direkt gemessen. Beim freien oder Gesamtcholesterin wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, wohingegen bei HG im Vergleich zu CG-, NG- und NG2P-Bedingungen ein niedrigeres verestertes Cholesterin auftrat (Abb. 2A–C).

Die Verfügbarkeit von Glukose wirkt sich auf das cNCC-Transkriptom aus. (A) Pearson-Korrelationswerte zwischen Modul-Genexpressionsniveau und Substratverfügbarkeit; hohe Glukose (HG = 25 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), Kontrollglukose (CG = 5,55 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), keine Glukose (NG = 0 mM Glukose, 1 mM Pyruvat) und keine Glukose mit 2 × Pyruvat ( NG2P = 0 mM Glucose, 2 mM Pyruvat) mit angepassten p-Werten (in Klammern) werden in jedem Bin angezeigt; Eine Korrelation von 1 oder -1 weist auf eine starke positive bzw. negative Beziehung hin. (B) Heatmaps und Balkendiagramme zeigen skalierte Genexpressions- und Eigengenwerte für die türkisen und blauen Module an. (C) Pathway-Analyse von Genen des blauen Moduls, gefiltert nach Modulmitgliedschaft > 0,6. (D) Heatmap von Genen, die an der Cholesterinbiosynthese beteiligt sind.

Die Verfügbarkeit von Glukose reguliert den Gehalt an verestertem Cholesterin im cNCC. Gesamt-, veresterte und freie Cholesterinspiegel normalisiert auf Protein in cNCC, das unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen kultiviert wurde. n = 3 pro Gruppe. Die Werte werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01.

Unser Ziel war es, die Bedeutung der Cholesterin-Biosynthese in der cNCC-Physiologie zu untersuchen, indem wir zwei Medikamente verwendeten, die strukturell unterschiedlich sind und den Cholesterin-Biosyntheseweg an unterschiedlichen Punkten beeinflussen. Fatostatin ist ein niedermolekularer Cholesterinsynthesehemmer, der die Aktivierung von SREBP-1 und -2 blockiert, den Hauptregulatoren der Cholesterin- und Fettsäuresynthese26. Fluvastatin hemmt direkt die HMG-CoA-Reduktase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Cholesterinbiosynthese27. Beide Medikamente wurden auch zur Hemmung der Cholesterinsynthese bei Neuroblastomen, einer von NCC abgeleiteten bösartigen Erkrankung, eingesetzt. Um die ideale Arbeitskonzentration von Fatostatin in O9-1-Zellen zu ermitteln, haben wir zunächst Veränderungen in der Genexpression der Cholesterinsynthese und der Zelllebensfähigkeit gemessen. Wir haben einen Konzentrationsbereich (5 bis 25 µM) ausgewählt, der auf früheren Experimenten basiert, die an embryonalen Zellen28 durchgeführt wurden. Mithilfe des Incucyte-Lebensfähigkeitstests für lebende Zellen identifizierten wir Konzentrationen von Fatostatin und Fluvastatin, die für cNCC nicht toxisch waren, basierend auf der Zellkonfluenz (Abb. 3A). Fatostatin reduzierte die Lebensfähigkeit von O9-1 cNCC bei 25 µM signifikant. Fatostatin reduzierte die Srebf2-, Hmgcr-, Hmgcs1-, Lss- und Mvd-mRNA-Spiegel bei 10 µM und 25 µM nach 48-stündiger Behandlung dramatisch (Abb. 3B). Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir für weitere Studien 10 μM als minimale Konzentration ausgewählt, die eine Hemmung der Cholesterinsynthese hervorrufen würde, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Um die beobachtete Unterdrückung der Cholesterinbiosynthese durch Fatostatin und Fluvastatin zu validieren, haben wir den Cholesterinspiegel mithilfe des Amplex Red-Assays in O9-1-Zellen unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen direkt gemessen. In Gegenwart von 10 µM Fatostatin wurden die Gesamt- und veresterten Cholesterinspiegel unter allen Glukosebedingungen signifikant gesenkt und die freien Cholesterinspiegel wurden unter NG- und NG2P-Bedingungen gesenkt (Abb. 3C). In Gegenwart von 10 µM Fluvastatin waren die Gesamtcholesterinspiegel bei CG und NG2P niedriger, die Werte des veresterten Cholesterins waren nur bei CG niedriger. Die freien Cholesterinspiegel waren bei HG, CG und NG2P nach der Behandlung mit Fluvastatin verringert. Somit war Fatostatin wirksamer bei der Unterdrückung des Gesamt- und veresterten Cholesterinspiegels als Fluvastatin, vermutlich weil es durch die Blockierung von SREBP-2 das Potenzial hat, den gesamten Cholesterin-Biosyntheseweg zu beeinflussen.

Hemmung der Cholesterinsynthese in O9-1 cNCC. (A) Lebensfähigkeit von O9-1 cNCC, kultiviert für 48 Stunden in Gegenwart von Fatostatin oder Fluvastatin bei 5, 10 und 25 µM im Vergleich zu Fahrzeugbedingungen („0“). n = 3 pro Gruppe. (B) Genexpressionsniveaus von Srebf2, Hmgcr, Hmgcs, Lss, Mvd normalisiert auf 18S-Niveaus in Zellen, die in HG kultiviert wurden und mit 0 (Vehikel), 5, 10 und 25 µM Fatostatin behandelt wurden. (C) Gesamt-, veresterte und freie Cholesterinwerte, normalisiert auf Protein in cNCC, kultiviert unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen in Abwesenheit (Vehikel) oder Anwesenheit von 10 µM Fatostatin von Fluvastatin. n = 3 pro Gruppe. Die Werte werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Der programmierte Zelltod bei cNCC ist von zentraler Bedeutung für die kraniofaziale Musterung/Formung29. Es wurde gezeigt, dass die Glukoseverfügbarkeit – insbesondere ein hoher, durch Glukose vermittelter Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies – die cNCC-Apoptose beeinflusst9. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass sowohl Fatostatin als auch Fluvastatin, ein direkter Inhibitor der HMG-CoA-Reduktase, apoptotische Wirkungen besitzen30,31,32,33. Wir waren daher daran interessiert, die Wirkung von Cholesterinhemmern auf die Anfälligkeit von cNCC für Apoptose unter verschiedenen Glukosebedingungen zu untersuchen. Wie erwartet führte ein erhöhter Glukosespiegel zu einem etwa 20-fachen Anstieg der Apoptose, der zum spätesten Zeitpunkt in Abwesenheit von Cholesterinsynthesehemmern statistische Signifikanz erreichte (Abb. 4A). Die Untersuchung der Apoptose in Gegenwart von Cholesterinsynthesehemmern ergab, dass nur die Behandlung mit Fatostatin zu einer erhöhten Apoptose führte (kein nennenswerter Unterschied zwischen Fluvastatin- und Vehikelbedingungen) und dass ihre Wirkung unabhängig von Glucose war (Abb. 4B).

Die durch Glukose vermittelte Regulierung des Cholesterinstoffwechsels könnte beim cNCC-programmierten Zelltod eine Rolle spielen. (A) Apoptose in cNCC, kultiviert unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen, aufgetragen als Funktion der Glukoseverfügbarkeit, um die Auswirkungen der Hemmung der Cholesterinsynthese zu untersuchen, wurde mit dem Incucyte-Lebendzell-Casp3/7-Apoptose-Assay gemessen. n = 6 Wells/Zustand; Für 3D wurden mehrere Bilder pro Vertiefung gesammelt. (B) Die Apoptose in cNCC, die unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen in Abwesenheit (Vehikel) oder Anwesenheit von 10 μM Fatostatin oder Fluvastatin kultiviert wurde, wurde mit dem Incucyte-Lebendzell-Casp3/7-Apoptose-Assay gemessen. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar. ****p < 0,0001.

Da die Migration aus dem Neuralrohr ein entscheidender Teil der cNCC-Ontogenese ist, fragten wir, ob die Blockierung der Cholesterinsynthese die cNCC-Migration beeinflusst (Abb. 5A, B). Die Migration wurde mit einem herkömmlichen Kratzwundentest gemessen, bei dem die Zellen ihre volle Konfluenz erreichen, bevor eine Wunde in die Zellmonoschicht eingebracht wird, um die Zellpolarisation und Migration in den resultierenden Raum zu induzieren (ergänzende Abbildung S2). Die Wundbreite war in Gegenwart von Fatostatin bei CG- und NG-Bedingungen signifikant größer, was mit einer verminderten Migrationsfähigkeit vereinbar ist. Die Behandlung mit Fluvastatin führte im Vergleich zur Vehikelbehandlung bei CG und NG auch zu einer größeren Wundbreite; Allerdings erreichte dieser Effekt nur im CG-Zustand statistische Signifikanz. Die Glukosekonzentration allein hatte keinen Einfluss auf die O9-1-cNCC-Migration (Abb. 5B).

Die Cholesterinbiosynthese spielt eine Rolle bei der cNCC-Migration. (A) Die Zellmigration von cNCC, die unter HG-, CG-, NG- und NG2P-Bedingungen in Abwesenheit (Vehikel) oder Anwesenheit von 10 μM Fatostatin oder Fluvastatin kultiviert wurden, wurde in einem Incucyte-Lebendzellanalysator mittels eines Kratzwundentests untersucht. n = 4 pro Gruppe; Mehrere Bilder pro Vertiefung wurden 36 Stunden lang jede Stunde gesammelt. Panel (B) zeigt dieselben Daten in Abwesenheit von Cholesterinsynthesehemmern, um den Effekt der Glukoseverfügbarkeit hervorzuheben. Jeder Datenpunkt repräsentiert Mittelwerte ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

cNCC sind multipotente Stammzellen, die während der Entwicklung eine Reihe von Zelltypen hervorbringen, darunter kraniale Neuronen, Gliazellen, glatte Muskelzellen, Osteoblasten und Chondrozyten30,34,35. Darüber hinaus wurden Mutationen in Genen des Cholesterinsynthesewegs mit Gesichtsdysmorphien in Verbindung gebracht, die aus einer durch fehlerhafte WNT-Signale vermittelten Modulation der Chondrozytendifferenzierung resultieren43,44.

Um zu beurteilen, ob der Cholesterinspiegel das Potenzial von cNCC zur Differenzierung in Chondrozyten beeinflusst36,37, führten wir einen Chondrogenese-Assay mit O9-1-Zellen unter HG- und CG-Bedingungen durch, da wir besonders am Vergleich von supraphysiologischen (ähnlich einer Hyperglykämie) und physiologischen (euglykämischen) Zellen interessiert waren. Bedingungen (Abb. 6). O9-1-Zellen wurden 3 Tage lang in osteogenem Differenzierungsmedium kultiviert, bevor sie 7 Tage lang in chondrogenem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, wie zuvor beschrieben35. Die Behandlung mit 10 µM Cholesterinsyntheseinhibitoren während des 10-tägigen Differenzierungsprozesses führte zu einer unterschiedlichen zellulären Konfluenz über die verschiedenen Glukosebedingungen hinweg; alle Differenzierungsversuche wurden daher in Gegenwart von 5 µM Fatostatin und Fluvastatin durchgeführt. Die Quantifizierung von Alcianblau – das zur spezifischen Färbung saurer Polysaccharide im Knorpel verwendet wird – zeigte, dass Fatostatin die Differenzierung in Chondrozyten sowohl bei HG- als auch bei CG-Bedingungen signifikant reduzierte, während Fluvastatin die Differenzierung bei CG-Bedingungen reduzierte (Abb. 6B). Der Gesamtcholesterinspiegel (gemessen am Ende der Chondrogenese) spiegelte einen ähnlichen Trend wider: Der Cholesterinspiegel wurde durch die Fatostatin-Behandlung sowohl unter HG- als auch unter CG-Bedingungen im Vergleich zum Vehikel gesenkt, während die Fluvastatin-Behandlung nur unter der CG-Bedingung zu einer Senkung des Cholesterins führte, was mit einer Rolle von übereinstimmt Cholesterin bei der Chondrogenese (Abb. 6C).

Eine verringerte Cholesterinsynthese verschiebt das Schicksal des cNCC weg von der Chondrogenese. (A) Alcianblau-Färbung von cNCC, kultiviert in Chondrogenesemedium unter HG- und CG-Bedingungen in Gegenwart von Vehikel oder 5 µM Fatostatin und Fluvastatin. Maßstabsbalken sind 50 µM. (B) Spektrophotometrische Quantifizierung von Panel-A-Bildern (4 cm2 Probenvertiefungen, n = 5 pro Gruppe). (C) Gesamtcholesterinspiegel, normalisiert auf Protein in cNCC, kultiviert in Chondrogenesemedium unter den angegebenen Bedingungen (n = 3 pro Gruppe). Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wir untersuchten auch die Fähigkeit von cNCC, sich in O9-1-Zellen, die unter HG- und CG-Bedingungen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 μM Fatostatin und Fluvastatin kultiviert wurden, in glatte Muskelzellen zu differenzieren (Abb. 7A). Die Quantifizierung der Aktin-Immunfluoreszenz der glatten Muskulatur zeigte, dass die Blockierung der Cholesterinsynthese durch die Behandlung mit Fatostatin oder Fluvastatin die Differenzierung in glatte Muskelzellen sowohl bei HG- als auch bei CG-Erkrankungen signifikant steigerte (Abb. 7B).

Die Hemmung der Cholesterinsynthese begünstigt die terminale Entwicklung der glatten Muskulatur. (A) Glattmuskel-Aktin-Immunfärbung von cNCC, kultiviert unter HG- und CG-Bedingungen in Gegenwart von Vehikel, Fatostatin und Fluvastatin (5 µM). Maßstabsbalken sind 50 µM. (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensitätsdichte/Fläche von cNCC, gefärbt mit Aktin der glatten Muskulatur, dargestellt in Panel A. n = 5 Bilder pro Gruppe. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wir richteten unsere Aufmerksamkeit wieder auf SMCHD1 und fragten, ob die Glukosekonzentration allein und die Hemmung der Cholesterinsynthese während der Chondrogenese die Smchd1-Expression beeinflussen könnten (Abb. 8A). Die Behandlung mit Fatostatin verringerte die Smchd1-mRNA-Expression sowohl bei CG- als auch bei HG-Erkrankungen, während die Behandlung mit Fluvastatin die Smchd1-Expression nur bei CG-Erkrankungen beeinflusste. Die Glukosekonzentration während der Chondrogenese hatte keinen Einfluss auf die Smchd1-Expression (Abb. 8A). Zu Studienbeginn war die Smchd1-mRNA-Expression jedoch in HG im Vergleich zu CG-, NG- und NG2P-Bedingungen (Abb. 8B) in O9-1-Zellen signifikant erhöht.

Hohe Glukosespiegel erhöhen die Smchd1-Expression in cNCC. (A), Smchd1-Genexpressionsniveaus normalisiert auf β-Actin-Niveaus in cNCC, kultiviert in Chondrogenesemedium unter den angegebenen Bedingungen (n = 3 pro Gruppe). (B), Smchd1 normalisierte die Genexpressionsniveaus (erhalten aus einer RNA-seq-Studie) in cNCC, kultiviert in HG, CG, NG und NG2P (n = 3 pro Gruppe). Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar. *p < 0,05, **p < 0,01.

NCCs sind eine Population früher embryonaler, multipotenter Vorläuferzellen, die nur bei Wirbeltieren vorkommen38. Sie entstehen aus dem embryonalen Ektoderm und durchlaufen einen Übergang vom Epithel zum Mesenchym, während sie sich delaminieren und durch den Körper wandern39 und tragen zu einer Vielzahl von Strukturen bei, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kraniofazialen Knorpel und Knochen, glatten Muskeln, Melanozyten, Myofibroblasten, peripheren/ enterische Neuronen und Gliazellen40. Die umfangreiche Migrationskapazität und Multipotenz von NCC ist mit einer Neuverdrahtung des Stoffwechsels verbunden und kann davon abhängen, was nicht nur dazu dient, den einzigartigen Energiebedarf dieser Zellen zu decken, sondern auch Metaboliten liefern kann, die die Gentranskription modulieren und dadurch die Differenzierung beeinflussen. Aufbauend auf früheren Studien, die auf eine zentrale Rolle der Glykolyse in diesem Prozess hinweisen3,8,9,10,20,41,42,43,44, wollten wir klären, wie sich Störungen der Glukoseverfügbarkeit auf die Physiologie des cNCC auswirken. Unsere RNA-seq-WGCNA- und Cholesterindaten legen nahe, dass unter erhöhten Glukosebedingungen – wie beispielsweise bei Schwangerschaftsdiabetes – die Cholesterinveresterung unterdrückt wird.

Wir untersuchten außerdem die biologische Relevanz der Cholesterinsynthese in Prozessen, die für die cNCC-Funktion von zentraler Bedeutung sind. Wir erreichten durch pharmakologische Hemmung der Cholesterinbiosynthese eine signifikante Herunterregulierung der Gene für die Cholesterinbiosynthese und des zellulären Cholesterinspiegels, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Wir beobachteten eine verringerte Zellmigration (vergrößerte Wundbreite) sowohl bei Fatostatin (CG- und NG-Zustand) als auch bei Fluvastatin (CG und Trend bei NG-Zustand). Interessanterweise veränderte die Hemmung der Cholesterinsynthese die Migration von O9-1-Zellen, die unter Glukosemangelbedingungen kultiviert wurden, bei Ergänzung mit 2 × Pyruvat nicht signifikant. Obwohl zuvor gezeigt wurde, dass ein hoher glykolytischer Fluss für eine ordnungsgemäße NCC-Migration erforderlich ist,45 deuten unsere Ergebnisse auch auf ein Zusammenspiel zwischen Pyruvat und der cholesterinvermittelten Regulierung der cNCC-Migration hin, das weitere Untersuchungen erfordert. Schließlich beobachteten wir in Gegenwart von Fatostatin (CG- und HG-Zustand) und Fluvastatin (nur CG-Zustand) eine verminderte Fähigkeit von cNCC, sich in Chondrozyten zu differenzieren, und eine Verschiebung hin zur Bildung glatter Muskelzellen. Eine Störung der Cholesterinbiosynthese führt zu einer fehlerhaften Sonic-Hedgehog-Signalübertragung, die eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und dem Überleben von cNCC spielt46,47. Darüber hinaus ist bekannt, dass cholesterinreiche Lipidflöße die kanonische Wnt-Signalübertragung regulieren, die an der Zellproliferation und der Bestimmung des Zellschicksals während der Embryonalentwicklung beteiligt ist. Tatsächlich haben Castro et al. zeigten, dass die Hemmung der Cholesterinsynthese bei Zebrafischen zu Gesichtsdefekten führte, die durch einen Wnt-Agonisten behoben werden konnten37. Die Wnt-Signalübertragung ist sowohl für die Chondrogenese49 als auch für die Entwicklung der glatten Muskulatur50 wichtig. Daher ist es möglich, dass eine Änderung der Wnt-Signalübertragung die Differenzierung hin zu einer glatten Muskulatur auf Kosten der Chondrozyten begünstigt. Zusammengenommen ergänzen unsere Ergebnisse frühere Studien36,37 und liefern weitere Beweise dafür, dass intrazelluläres Cholesterin ein wichtiges endogenes Signal sein könnte, das das Schicksal des cNCC bestimmt51.

Es liegen keine Studien an menschlichen NCC vor, die belegen, dass sie zur Cholesterinbiosynthese fähig sind. Transkriptionsprofile aggressiver Maus- und menschlicher Neuroblastomzellen, einer von NCC abgeleiteten bösartigen Erkrankung, haben jedoch eine erhöhte Cholesterinbiosynthese gezeigt, die durch das regulatorische Element des Transkriptionsfaktors Sterol gesteuert wird Bindungsprotein-2 (SREBP-2)26. Lipidtröpfchen wurden auch in wandernden und postwandernden Rumpf-NCC in E8.5–9.5-Mausembryos52 identifiziert, was auf ein potenzielles Cholesterinreservoir hinweist. Darüber hinaus ist das Smith-Lemli-Opitz-Syndrom, eine seltene menschliche Erkrankung, die durch einen Defekt der 7-Dehydrocholesterin-Reduktase verursacht wird, mit dysmorphen Merkmalen verbunden, die den Kopf (z. B. Mikrozephalie), das Gesicht (z. B. Gaumenspalte) und die Extremitäten (z. B , Poly- oder Syndaktylie) sowie Herz- und Darmdefekte (Aganglionose), die teilweise auf eine beeinträchtigte NCC-Funktion zurückzuführen sein können53. Schließlich identifizierten frühere Studien an Zebrafischen, die mutiertes HMGCS und HMGCR, kritische Enzyme im Cholesterinbiosyntheseweg, trugen, Missbildungen im Schädelknorpel aufgrund einer mangelhaften NCC-Differenzierung36,54, was mit unseren Daten über die Verwendung von Cholesterininhibitoren während der Chondrogenese bei O9-1 cNCC übereinstimmt.

Angesichts der phänotypischen Variabilität in unserer Arhinia-Kohorte und unseres Interesses an potenziellen Umweltmodifikatoren, die in der Gebärmutter wirken, waren wir auch an den Auswirkungen der Verfügbarkeit von Glukose und Cholesterin auf die Smchd1-Expression während der Chondrogenese interessiert. Wir beobachteten, dass die Smchd1-mRNA-Expression bei höheren Glukosespiegeln zunahm und nach Abschluss der Chondrogenese in Gegenwart von Fatostatin (HG und CG) und Fluvastatin (CG) niedriger war. Somit scheint die Smchd1-Expression sowohl auf die Glukoseverfügbarkeit als auch auf den zellulären Cholesteringehalt (während der Chondrogenese) empfindlich zu sein. Wenn menschliche SMCHD1-Missense-Mutationen tatsächlich in einer Gain-of-Function-Manier wirken16, könnte ein durch höhere Glukosewerte bedingter Anstieg der Smchd1-Expression möglicherweise den Phänotyp verschlimmern, wohingegen eine Abnahme der Expression während der Chondrogenese zu einem milderen Phänotyp (z. B. Nasenhypoplasie) führen könnte oder Anosmie). Es ist auch denkbar, dass eine Frau während der Schwangerschaft unwissentlich Statinen natürlichen und pilzlichen Ursprungs ausgesetzt ist. Obwohl Statine nicht eindeutig mit Geburtsfehlern in Verbindung gebracht wurden55,56, könnte die Exposition gegenüber Statinen in der Gebärmutter die phänotypischen Auswirkungen einer bestehenden SMCHD1-Mutation verändern und zu einer verringerten SMCDH1-vermittelten repressiven Aktivität und Variabilität der menschlichen Phänotypen bei SMCHD1-Mutationsträgern beitragen15.

Insgesamt zeigt unsere Studie eine entscheidende Rolle für eine neuartige, glukosevermittelte Modulation der Cholesterogenese, die als „Torwächter“ der cNCC-Physiologie und -Funktion fungiert und Stoffwechselsignale liefert, die die Zellproliferation, -migration und -differenzierung beeinflussen. Cholesterin spielt eine wichtige Rolle bei der Migration und Differenzierung von cNCC-Zellen der Maus in Richtung einer chondrogenen oder myogenen Abstammungslinie, einem wichtigen Modulationsprozess, der durch supraphysiologische Glukosekonzentrationen, wie sie bei Schwangerschaftsdiabetes beobachtet werden, gedämpft wird. Wir zeigen auch, dass die Expression des epigenetischen Repressors Smchd1 empfindlich auf Glukose (in O9-1-Medien) und auf die Cholesterindosierung während der Chondrogenese reagiert, was eine zusätzliche Bestätigung des Zusammenhangs zwischen Cholesterin, cNCC-Physiologie und kraniofazialer Entwicklung darstellt. Weitere Studien, einschließlich der Frage, ob eine Hochregulierung des Cholesterins diese zellulären Phänotypen retten kann oder nicht, sind erforderlich, um die mechanistischen Grundlagen dieser cholesterinvermittelten Regulierung des cNCC-Verhaltens unter Bedingungen unterschiedlicher Glukoseverfügbarkeit abzugrenzen.

O9-1-Zellen waren ein Geschenk von K. Shpargel (UNC-Chapel Hill). Die Zellen wurden auf Matrigel-beschichteten Vertiefungen bei 37 °C, 5 % CO2 in mit embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) konditionierten Basalmedien, ergänzt mit 25 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, R&D Systems) und 1000 U/ml Leukämie-Inhibitor, expandiert Faktor (LIF, Millipore) wie zuvor beschrieben3. Für RNAseq- und Cholesterinanalysen wurden Zellen mit 10–15.000 Zellen/cm2 ausgesät und 48 Stunden nach Erreichen einer Konfluenz von > 80 % geerntet.

RNA-Proben für qPCR und RNAseq wurden aus dreifachen Kulturen von O9-1-Zellen extrahiert, die unter verschiedenen Substratbedingungen gezüchtet und mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) gereinigt wurden. Die RNA-Konzentration wurde mit dem Qubit™ RNA HS Assay Kit und Fluorometer (Invitrogen) gemessen.

Bibliotheken wurden mit dem TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina, RS-122–2001) gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Gereinigte Bibliotheken wurden auf einem Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer mit einem Agilent High Sensitivity DNA Kit quantifiziert. Die Bibliotheken wurden auf einer Illumina NovaSeq 6000-Plattform sequenziert, um Single-End-Reads mit 150 Basenpaaren zu generieren. Die FastQC-Software57 wurde verwendet, um die Qualität der Sequenzierung zu bewerten, und Lesevorgänge mit einem Phred-Qualitäts-Score < 20 wurden verworfen. Die verbleibenden hochwertigen Messwerte wurden mit dem STAR-Aligner58 auf das Referenzgenom der Maus (mm10) ausgerichtet. Das Dienstprogramm „featuresCounts“ aus dem Subread-Paket wurde verwendet, um Lesevorgänge zu quantifizieren, die auf Gencode v.32-Mausgene ausgerichtet waren, und eine differenzielle Expressionsanalyse wurde mit DeSeq259,60 durchgeführt. Gene mit einer log2-fachen Änderung > 1 und einem Bonferroni-adjustierten p < 0,05 wurden als differentiell exprimiert angesehen.

Normalisierte Expressionswerte wurden unter Verwendung der DeSeq2-Median-of-Ratios-Methode60 erhalten. Informative Gene für die Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) wurden aufgrund hoher Variabilität und mit normalisierten Expressionswerten > 5 in der Hälfte der Proben ausgewählt. WGCNA wurde mit dem Dienstprogramm blockwiseModule mit folgenden Parametern durchgeführt: Soft Threshold = 22, NetworkType = „Signed“, TomType = „Signed“, DeepSplit = 2, MinClusterSize = 30, CutTreeDynamic = 0,2522. Module mit einer Ähnlichkeitsschwelle von mehr als 0,25 wurden zusammengeführt. Gene mit einer Modulmitgliedschaft > 0,6 für das zugewiesene Modul wurden für die Pathway-Analyse mit dem R gProfileR-Softwarepaket61 ausgewählt.

Es wurde das WGCNA-Paket der R-Software (Version 4.1.2) (Version 1.71; https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-559?ref=https://githubhelp.com)22 verwendet zu den Feldern in Abb. 1. Die Korrelation zwischen dem Modul-Eigengenwert, der die erste Hauptkomponente der Genexpressionsmatrix für ein bestimmtes Modul ist und das Genexpressionsmuster für dieses Modul darstellt, und dem Glukosesubstrat ist in Abb. 1 dargestellt . Pearson-Korrelationswerte zwischen Modul-Eigengenwert und Substratverfügbarkeit; hohe Glukose (HG = 25 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), Kontrollglukose (CG = 5,55 mM Glukose, 1 mM Pyruvat), keine Glukose (NG = 0 mM Glukose, 1 mM Pyruvat) und keine Glukose mit 2 × Pyruvat ( NG2P = 0 mM Glucose, 2 mM Pyruvat) mit angepassten p-Werten (in Klammern) werden in jedem Bin angezeigt; Eine Korrelation von 1 oder -1 weist auf eine starke positive bzw. negative Beziehung hin. Die positive Korrelation für das blaue Modul zeigt beispielsweise an, dass Gene innerhalb dieses Moduls eine erhöhte Genexpression aufweisen, wenn das Substrat von HG- zu NG2P-Versuchsbedingungen wechselt. Umgekehrt weisen Gene, die dem türkisfarbenen Modul zugeordnet sind, eine verringerte Expression auf, wenn das Substrat von HG- auf NG2P-Bedingungen wechselt.

Lipide wurden mit dem Lipidextraktionskit (Abcam) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Kurz gesagt, gefrorene Zellpellets wurden mit Extraktionspuffer behandelt und 5 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein sauberes Röhrchen überführt und über Nacht bei 37 ° C getrocknet. Die Extrakte wurden in 50 µL Resuspensionspuffer resuspendiert. Der Gesamtcholesterinspiegel wurde mit dem Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben gemessen. Die Probenfluoreszenz wurde durch Anregung bei 550 nm und Emissionsdetektion bei 590 nm gemessen. Der Cholesterinspiegel wurde auf den Proteinspiegel normalisiert und die Ergebnisse als Prozentsatz des Cholesterinspiegels unter HG-Vehikelbedingungen ausgedrückt.

Automatische Incucyte-Casp3/7-Apoptosetests62 mit lebenden Zellen wurden in Echtzeit an Kulturen durchgeführt, die zu etwa 30 % konfluent waren. Die Tests wurden mit einem Incucyte-Lebendzellanalysesystem (Sartorius) durch direkte Behandlung mit Incucyte Caspase-3/7-Farbstoffen, Überwachung durch Zeitrafferbildgebung (alle 2 Stunden für 3 Tage) und Apoptosequantifizierung mit dem Incucyte Cell-by durchgeführt -Cell Analysis Software Module63 (Essen Bioscience). Die cNCC-Migration wurde mit dem Incucyte Scratch Wound Assay64 untersucht. Kurz gesagt, O9-1-Zellen wurden auf Matrigel-beschichteten Incucyte Imagelock-Platten ausgesät und in geeigneten Medien kultiviert, bis die Zellmonoschicht eine Konfluenz von 100 % erreichte. Mit dem Woundmaker-Tool wurden Wunden erstellt, um präzise, gleichmäßige zellfreie Zonen in der Zellmonoschicht zu erzeugen. Die Vertiefungen wurden 36 Stunden lang stündlich abgebildet und die Zellmigration wurde mit dem Incucyte Scratch Wound Analysis Software-Modul64 (Essen Bioscience) quantifiziert.

O9-1-Zellen wurden in Matrigel-beschichteten Vertiefungen in Basalmedium ausgesät. Monoschichtkulturen wurden zunächst mit osteogenem Medium (α-MEM, 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 μM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 100 ng/ml behandelt). ml BMP2 (Lieferant) für 3 Tage. Nach 3 Tagen wurden die Zellen auf chondrogenes Medium (α-MEM, 5 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % ITS (Lieferant), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml umgestellt Streptomycin, 10 ng/ml TGF-β3 (Hersteller), 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 ng/ml BMP2 (Lieferant), 0,1 μM Dexamethason und 1 mM Natriumpyruvat) und 7 Tage lang kultiviert.

Die chondrogene Differenzierung wurde durch Alcianblau-Färbung beurteilt65. Das Medium wurde entfernt und die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden gewaschen und 30 Minuten lang in Alcianblau-Lösung (Millipore) inkubiert. Kerne wurden mit Nuclear Fast Red-Lösung (Abcam) gefärbt. Die Alcianblau-Färbung wurde durch spektrophotometrische Quantifizierung von Zellen in 4 cm2/Probenvertiefungen bei 620 nm gemessen.

O9-1-Zellen wurden in Matrigel-beschichteten Vertiefungen in Basalmedium ausgesät. Monoschichtkulturen wurden 7 Tage lang in Differenzierungsmedium für glatte Muskeln (DMEM, 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) gehalten und für nachfolgende Experimente fixiert.

Um die Differenzierung der glatten Muskulatur nachzuweisen, wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer 10-minütigen Permeabilisierung mit 0,4 % Triton X-100/DPBS. Die Zellen wurden mit 10 % BSA/0,1 % Tween 20 blockiert, mit Glattmuskel-Aktin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) und einem mit einem Fluorophor markierten Sekundärantikörper (Invitrogen) inkubiert; Kerne wurden mit Hoechst 33.342 gefärbt.

O9-1-Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, 10 Minuten lang bei RT fixiert. Die Zellen wurden mit PBS 0,4 % Triton X-100 10 Minuten lang permeabilisiert. Die Zellen wurden mit 10 % BSA PBS 0,1 % Tween 20 blockiert. Die Zellen wurden mit Glattmuskel-Aktin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology) in 3 % BSA PBS 0,1 % Tween 20 inkubiert. Die Zellen wurden mit fluorophormarkiertem Sekundärantikörper (Invitrogen) in 3 % inkubiert. BSA PBS 0,1 % Tween 20. Die Kerne wurden mit Hoechst gefärbt.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem iScript cDNA-Synthesekit (Bio-Rad) revers transkribiert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung eines CFX96-Echtzeitsystems mit einem sso advanced universal SYBR green super mix (Bio-Rad) durchgeführt. Die β-Actin-Expression wurde verwendet, um das interessierende Gen in jeder Probe zu normalisieren. Quantitative Echtzeit-PCRs wurden unter Verwendung der Oligonukleotidprimer β-Actin F 5-CGCATCCTCTTCCTCCCTGG-3', β-Actin R 5-GTGGTACCACCAGACAGCAC-3', Hmgcs F 5-TGATCCCCTTTGGTGGCTGA-3'; Hmgcs R 5'-AGGGCAACGATTCCCACATC-3', Hmgcr F 5-ATCCTGACGATAACGCGGTG-3'; Hmgcr R 5'-AAGAGGCCAGCAATACCCAG-3', 18S F 5-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'; 18S R 5'-CGCTCCCAAGATCCAACTAC-3', Lss F 5-GGGCTGGTGATTATGGTGGT-3'; Lss R 5'-CTCGATGTGCAAGCCCCA-3', Mvd F 5-ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG-3'; Mvd R 5'-TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT-3', Smchd1 F 5'-GATGGCCTTGACAGCTCAAAC-3, Smchd1 5'-CGCCAAGTAAAACACAGATCCTT-3', Srebf2 F 5-GACCGCTCTCGAATCCTCTTATGTG-3'; Srebf2 R 5'-GTTTGTAGGTTGGCAGCAGCA-3'. Die Faltungsänderung wurde durch Berechnung von 2−ΔΔCt ermittelt.

Die Daten wurden mit Prism 9 (GraphPad-Software) analysiert. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA mit dem Dunnett-Test für mehrere Vergleiche und eine zweifaktorielle ANOVA mit dem Tukey-Test für mehrere Vergleiche bestimmt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Sequence Read Archive (SRA)-Repository (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) unter der Zugangsnummer PRJNA883392 verfügbar.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [NIEHS] (1ZIAES103327-03 an NDS und Z01 ES102005 an MBF) unterstützt. NDS wird auch als Lasker Clinical Research Scholar (1SI2ES025429–01) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH). Diese Arbeit wurde teilweise durch das Intramural Research Program der National Institutes of Health und des National Institute of Environmental Health Sciences (1Z1AES103327-05 und Z01 ES102005) unterstützt. NDS wird auch als Lasker Clinical Research Scholar (1SI2ES025429-01) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Florencia Pascual und Mert Icyuz.

Abteilung für klinische Forschung, National Institute of Environmental Health Sciences, 111 TW Alexander Drive, MD D3-02, Research Triangle Park, NC, 27709, USA

Florence Easter, Mert Icyuz, Elizabeth Van Gorder und Natalie D. Shaw

Labor für Immunität, Entzündung und Krankheit, National Institute of Environmental Health Sciences, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, NC, USA

Peer Karmaus und Michael B. Fessler

Abteilung für Biostatistik und Computerbiologie, National Institute of Environmental Health Sciences, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, NC, USA

Ashley Brooks

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FP: Konzeption, Design und Durchführung von Experimenten, Datenerfassung, Datenanalyse und -interpretation, Verfassen von Arbeiten, MI: Design und Durchführung von Experimenten, Datenerfassung, Datenanalyse und -interpretation, Verfassen von Arbeiten, PK: Datenanalyse und -interpretation, Bearbeitung Arbeit, AB: Datenanalyse und Interpretation, Redaktionsarbeit, EV: Durchführung von Experimenten, MBF: Konzeption, Redaktionsarbeit, NDS: Konzeption, Überwachung von Experimenten, Datenanalyse und Interpretation, Schreib- und Redaktionsarbeit. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Natalie D. Shaw.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pascual, F., Icyuz, M., Karmaus, P. et al. Die Cholesterinbiosynthese moduliert die Differenzierung in kranialen Neuralleistenzellen der Maus. Sci Rep 13, 7073 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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Eingegangen: 5. Januar 2023

Angenommen: 04. April 2023

Veröffentlicht: 01. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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