Nachweis von in Plasma eingebrachtem NO3− - Shijiazhuang Schwanensee Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12525 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Entladungsplasma bestrahlt Samen mit reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS). Durch Plasmabestrahlung in Samen eingeführte RONS konnten jedoch bisher nicht erfolgreich nachgewiesen werden. Diese Studie liefert experimentelle Beweise dafür, dass das Nitration NO3− in Salatsamen als RONS bei Bestrahlung mit Atmosphärendruck-Luft-Entladungsplasma mit dielektrischer Barriere eingeführt wird. Eine 5-minütige Plasmabestrahlung fördert die Samenkeimung. Die Komponenten der plasmabestrahlten Samen wurden mittels Elektrospray-Ionisations-Quantenmassenspektrometrie (ESI QMS) untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Plasmabestrahlung ein Ion mit einer Masse von 62 m/z in nachweisbaren Mengen einführte. Dieses Ion wurde durch Flüssigkeitschromatographie (LC), Mehrfachwellenlängendetektor (MWD) und LC-ESI-QMS als NO3− identifiziert. Eine eindimensionale Simulation bei einer Elektronentemperatur Te = 1 eV, einer Elektronendichte Ne = 1013/m3 und einer Gastemperatur Tg = 300 K deutete auf die Einführung von NO3− unter Beteiligung von Stickoxid NO hin. NO3− ist eines der wichtigsten Ionen, das beim Einbringen in Samen die Signalübertragung für die Keimung auslöst. Die Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) zeigten, dass es nach der Plasmabestrahlung keine Veränderungen an der Oberfläche der Samen gab. Die Plasmabestrahlung ist eine wirksame Methode, um NO3− im Trockenverfahren in Samen einzubringen, ohne Schäden zu verursachen.

Der wachstumsverbessernde Effekt der Plasmabestrahlung auf Pflanzen hat weltweit große Aufmerksamkeit erregt1,2,3. Bisher gab es bahnbrechende Studien zur Verbesserung der Keimung und des Wachstums4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 sowie zur Kontrolle des Hormonhaushalts zwischen Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in Samen20,21 und Verbesserung der Ernteeigenschaften22 durch Plasmabestrahlung. Kürzlich wurden molekularbiologische Studien durchgeführt, um die Mechanismen aufzuklären, die den biologischen Wirkungen der Plasmabestrahlung zugrunde liegen23. Plasma kann Samen mit reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS), Photonen und Ionen bestrahlen und sie elektrischen Feldern aussetzen24. RONS sind an einer Vielzahl von Samenprozessen beteiligt, darunter Reifung, Alterung und Keimung, gefolgt vom Keimlingswachstum25,26. Exogene reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verbessern die Samenkeimung von Zea mays und Helianthus annuus, indem sie die GA-Biosynthese und den ABA-Katabolismus induzieren27. Kolorimetrische Bestimmungen und Simulationen sind nützlich, um die Menge an in Samen eingebrachten RONS abzuschätzen. Durch Plasmabestrahlung in Samen eingeführte RONS konnten jedoch bisher nicht erfolgreich nachgewiesen werden. In Anbetracht der Tatsache, dass sich viele Studien mit der Auslösung biologischer Reaktionen in Samen durch Plasmabestrahlung befassen, sollten Diskussionen über die zugrunde liegenden Mechanismen auf den tatsächlich in die Samen eingebrachten Partikeln basieren. Diese Studie liefert experimentelle Beweise dafür, dass Nitrationen NO3− bei Plasmabestrahlung als RONS in Samen eingeführt werden.

Wir haben versucht, die typischen RONS, NO3−, nachzuweisen, die bei Bestrahlung mit nichtthermischem Luftplasma bei Atmosphärendruck in Samen eingeführt werden. Die Reaktion von Samen auf exogene NO3−-Verabreichung ist ein wichtiges Forschungsthema in der Molekularphysiologie von Pflanzen. NO3− in Pflanzensamen ist für die Auslösung von Reaktionen wie Ruhepause, Genexpressionsregulation, Signaltransduktion und ABA-Metabolismus verantwortlich, die aus der NLP8-Bindung an den CYP707A2-Promotor resultieren28,29,30,31,32. Obwohl es viele Studien zu den Veränderungen im Genotyp und Phänotyp aufgrund der Verabreichung von NO3− gibt, bleibt der molekulare Mechanismus hinter der Reaktion der Pflanze auf NO3− unklar30. Ziel dieser Studie war es daher, experimentell nachzuweisen, dass NO3− durch Plasmabestrahlung in Samen eingebracht wird; Ein wahrscheinlicher Mechanismus für diese Einführung wird ebenfalls vorgeschlagen. Außerdem wurde eine neue Methode zur Verabreichung von NO3− an Samen in einem Trockenverfahren unter Verwendung von Plasma vorgeschlagen.

In Anbetracht der Tatsache, dass die Einführung von NO3− in Samen durch Plasmabestrahlung das Niveau der Nahrungsmittelproduktion steigern könnte, wurde Salat (Lactuca sativa L.), die am häufigsten in der Industrie angebaute Pflanze33, in Erwartung einer raschen gesellschaftlichen Umsetzung als biologisches Material verwendet der Plasmatechnologie. Abbildung 1 zeigt die Keimeigenschaften von Samen, die 1, 3 und 5 Minuten lang mit Plasma bestrahlt wurden, und von nicht bestrahlten Samen. Dieses Ergebnis wurde unter Verwendung von drei biologischen Replikaten erhalten. Die Markierungen und Fehlerbalken geben Durchschnittswerte bzw. Standardabweichungen an. Nach 24 Stunden begannen die Samen mit einer relativ großen Abweichung zu keimen; Die prozentuale Keimung war bei den Samen mit (w/o) Plasmabestrahlung immer höher als bei denen ohne (w/o) Plasmabestrahlung, was darauf hindeutet, dass die Plasmabestrahlung die Samenkeimung fördert. Diese Variabilität war wahrscheinlich auf die Überlebensstrategie der Pflanze und die durch das Plasma eingeführte Menge an RONS zurückzuführen. Da der p-Wert des Samens mit 5 Minuten Plasmabestrahlung im Vergleich zu dem (0,027) des Samens ohne Plasmabestrahlung nach 48 Stunden im zweiseitigen Test um 69 % anstieg, wurde eine Plasmabestrahlungsdauer von 5 Minuten gewählt weitere Experimente.

Keimeigenschaften von Salatsamen ohne und mit (1, 3 und 5)-minütiger Plasmabestrahlung.

Zum Nachweis von NO3− in den Samen wurde Elektrospray-Ionisations-Quantenmassenspektrometrie (ESI QMS) verwendet. Abbildung 2 zeigt die MS-Spektren von (a) ultrareinem Wasser (Blindwert), (b) der Probe ohne Plasma und (c) der Probe mit 5-minütiger Plasmabestrahlung. Die Peaks S1, S2, S3, S4, S5 und S6 sind in Abb. 2a – c dargestellt. Diese Peaks werden sogar in ultrareinem Wasser beobachtet (Abb. 2a) und es wird daher angenommen, dass sie vom LC-QMS-System stammen. Die Intensitäten der Peaks S1 bis S6 in Abb. 1b und c sind größer als die in Abb. 2a. Dies könnte auf den Matrixeffekt von Saatgutverunreinigungen zurückzuführen sein. Umgekehrt sind die M1- und M2-Peaks nur für den Samenextrakt in Abb. 1b und c zu finden, was darauf hinweist, dass diese beiden Peaks vom Samenmaterial stammen. Die Intensitäten der M1- und M2-Peaks in Abb. 2b sind fast die gleichen wie in Abb. 2c, was darauf hinweist, dass die Konzentrationen der Probe ohne und mit Plasma gleich sind und dass die Plasmabestrahlung die wesentliche Zusammensetzung nicht verändert im Massenbereich von 50–80 m/z. Dennoch ist in Abb. 2c deutlich ein Peak X bei 62 m/z (angezeigt durch einen Pfeil) zu beobachten.

Typische MS-Spektren von (a) Leerwert und Extrakt von 20 Samen (b) ohne Plasmabestrahlung und (c) mit 5-minütiger Plasmabestrahlung, erhalten durch QMS.

Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit mit fünf biologischen Replikaten zu bewerten. Die MS-Spektren im Massenbereich von 60–64 m/z von 20 Samen ohne Plasmabestrahlung sind in Abb. 3a und diejenigen mit Plasmabestrahlung in Abb. 3b dargestellt. Wir führten drei Messungen pro Wiederholung durch und erhielten die integrierten Werte. Die Markierungen und Fehlerbalken geben Durchschnittswerte bzw. Standardabweichungen an. Die relative Intensität bei 62 m/z ohne Plasmabestrahlung betrug 131,96 ± 0,31, was fast dem Ausgangswert (131) entsprach, für Samen mit Plasmabestrahlung jedoch 141,53 ± 1,83 betrug. Die Peakfläche war im Extrakt mit Plasma signifikant höher (p = 0,00012, bestimmt durch einen zweiseitigen t-Test) als im Extrakt ohne Plasmabestrahlung. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass durch Plasmabestrahlung erzeugte 62 m/z-Moleküle in die Samen eingeführt wurden. Wenn man bedenkt, dass die optischen Emissionsspektren von Plasma mit skalierbarer dielektrischer Barrierenentladung (SDBD) NO (200–250 nm)34 zeigen, ist das Nitration (NO3−) unter den langlebigen Spezies in Luftplasmen ein Hauptkandidat für Peak X. NO3− kann durch Elektronenstoßionisationsreaktionen von N2, O2 und H2O in der Gasphase erzeugt werden, wie in den Reaktionen (R1)–(R7)35 gezeigt

MS-Spektrum von 60–64 m/z eines Extrakts aus 20 Samen (a) ohne Plasmabestrahlung und (b) mit 5-minütiger Plasmabestrahlung, erhalten im QMS-Modus. Drei Aufnahmen wurden integriert. Markierungen und Fehlerbalken zeigen Mittelwerte bzw. Standardabweichungen der Dreifachbestimmung.

Zur Identifizierung des 62 m/z-Peaks wurden ein Flüssigkeitschromatographie (LC)-Multiwellenlängendetektor (MWD) und ein LC-ESI-QMS verwendet. Die Chromatographie ist wirksam bei der Messung der NO3−-Menge im Samenextrakt aus Verunreinigungen wie Enzymen, Proteinen und darin enthaltenen organischen Metallen. Das Nitration absorbiert eine Wellenlänge von ~ 224 nm und sein isosbestischer Punkt liegt bei 215 nm36. Für die MWD wurde eine Wellenlänge von 210 nm verwendet, um Störungen durch Peptidbindungen von Proteinen im Samenextrakt zu vermeiden, die bei 228 nm absorbieren37. Es wurde berichtet, dass NO3− ein Hauption ist, das in plasmabestrahltem Wasser vorkommt1,38; Daher wurde auch ultrareines Wasser mit Plasma bestrahlt und für die Analyse verwendet. Abbildung 4 zeigt das MWD-Chromatogramm bei 210 nm für (a) Blindprobe (ultrareines Wasser), (b) Standardlösung von NO3− bei 1 µM, (c) ultrareines Wasser ohne Plasmabestrahlung, (d) ultrareines Wasser Wasser mit Plasmabestrahlung, (e) Samenextrakt ohne Plasmabestrahlung und (f) Samenextrakt mit Plasmabestrahlung. Die innerhalb von 2 Minuten beobachtete Störung ist auf den Injektionsschock zurückzuführen und wird daher vernachlässigt. Abbildung 4a zeigt nach 2 Minuten keine Peaks im Blindwert (reines Wasser, das zur Vorbereitung der Samenextraktion verwendet wurde). Zur Verdünnung des Standardreagenzes NO3− wurde hochreines Wasser verwendet. Ein NO3− entsprechender Peak erscheint bei 5,84 Minuten in der MWD, wie in Abb. 4b dargestellt. Obwohl es in Abb. 4c keinen NO3−-Peak gibt, können wir in Abb. 4d und f einen Peak mit hoher Intensität finden, der zeigt, dass NO3− durch Plasmabestrahlung in ultrareines Wasser und Samen eingeführt wird. Ein kleiner NO3−-Peak wurde auch in Samen ohne Plasmabestrahlung beobachtet. Der Samenextrakt hatte nach 3–5 Minuten mehrere Peaks, wie in Abb. 4e und f gezeigt, und die Flächen dieser Peaks sind nahezu gleich, wohingegen sich die NO3−-Peakflächen deutlich voneinander unterscheiden, d. h. 81,05 und 1486,04 für w/o bzw. w/Plasma. Nach dem Lambert-Beer-Gesetz scheint die Menge an NO3− in den Extrakten von Samen, die einer Plasmabestrahlung ausgesetzt sind, beträchtlich hoch zu sein. Es kann jedoch nicht geleugnet werden, dass die Plasmabestrahlung möglicherweise ein Ion im Samen erzeugt hat, das möglicherweise UV-Strahlung bei etwa 210 nm mit der gleichen Retentionszeit wie NO3− absorbiert hat. Daher haben wir ein LC-ESI-QMS-Experiment durchgeführt, das den Ergebnissen der Abbildungen entspricht. 2, 3 und 4.

MWD-Chromatogramme von 210 nm von (a) Leerwert, (b) Standardlösung von NO3− mit einer Konzentration von 1 µM, ultrareinem Wasser (c) ohne Plasmabestrahlung und (d) mit Plasmabestrahlung für 300 s und Samenextrakt (e) ohne Plasmabestrahlung und (f) mit Plasmabestrahlung für 5 Minuten.

Die Isotopenverteilung eines zu analysierenden Moleküls ist einzigartig für seine Struktur und sehr effektiv bei der Identifizierung derjenigen, die auf die nachgewiesene Masse hinweisen. Da in jedem der Stickstoff- und Sauerstoffatome stabile Isotope vorhanden sind, wurde der Anteil von NO3− mit dem Isotopenverteilungsrechner (Agilent MassHunter Workstation Data Analysis Core; Version 10.0) berechnet; Damit können wir die Masse abschätzen, die vorwiegend für NO3− nachgewiesen wird. Die berechneten Werte waren 61,99 m/z, 62,99 m/z, 63,99 m/z und 64,99 m/z Masse, entsprechend 98,91 %, 0,47 %, 0,61 % bzw. 0,00 % der Häufigkeit, was darauf hindeutet, dass etwa 99 % Das in der Natur vorkommende NO3− ergibt eine Masse von 62 m/z. Um 62 m/z NO3− zu identifizieren, wurde folglich ein Chromatogramm von 62 m/z für das Standardreagenz NO3− und den Extrakt aus mit Plasma bestrahlten Samen erhalten. Die Massenauflösung des QMS lag innerhalb von 1 m/z. Das Zusammentreffen dieser Retentionszeiten deutete stark darauf hin, dass es sich um dieselben Substanzen handelte. Obwohl die Signalintensität beim extrahierten Ionenchromatogramm (EIC) bei hohen Konzentrationen in die Sättigung geht, können damit Substanzen in geringeren Mengen nachgewiesen werden als bei der MWD. Abbildung 5 zeigt den ESI von 62 m/z für (a) Blindwert, (b) Standardlösung von NO3− bei 1 µM, (c) Reinstwasser ohne Plasmabestrahlung, (d) Reinstwasser mit Plasmabestrahlung, (e) Saatgut Extrakt ohne Plasmabestrahlung und (f) Samenextrakt mit Plasmabestrahlung. Abbildung 5 wurde aus derselben Probe wie in Abb. 4 erhalten, um die Kontamination und Konzentrationsschwankungen innerhalb der Verdünnungsprozesse zu eliminieren. Es gibt keinen Peak im Rohling, wie in den Abbildungen gezeigt. 5a und 4a. Das Standardreagenz zeigte einen Peak bei einer Retentionszeit von 5,8–6,3 Minuten, wie in Abb. 5b dargestellt. Abbildung 5c und d zeigen ultrareines Wasser mit bzw. ohne Plasma. Während der Plasmabestrahlung wurde hochreines Wasser in eine Quarz-Petrischale gegeben. In dem ultrareinen Wasser, das einfach in die Quarz-Petrischale gegeben wird (ohne Bestrahlung), erscheint kein Peak, wie in Abb. 5c gezeigt, wohingegen ein großer Peak bei einer Retentionszeit von 5,8–7,0 Minuten auftritt, wenn dieselbe Probe mit Plasma bestrahlt wird , wie in Abb. 5d gezeigt. Diese Retentionszeit lag im gleichen Bereich wie die des Standardreagenzes. Somit wurde das durch Plasmabestrahlung erhaltene 62 m/z-Ion als NO3− identifiziert. Für den Samenextrakt wurden Peaks im gleichen Retentionszeitbereich wie in Abb. 5e und f gefunden, was darauf hindeutet, dass NO3− bereits vor der Plasmabestrahlung im Samen vorhanden war; seine Menge nahm bei Plasmabestrahlung zu. Die Standardabweichungen (±) in den mittleren Peakflächen für den Samenextrakt betrugen 4,6 × 103 ± 660,5 und 3,9 × 104 ± 4154,9 mit bzw. ohne Plasmabestrahlung. Der statistische t-Test ergab, dass p = 0,0006. Obwohl klar ist, dass NO3− durch Plasmabestrahlung in die Samen eingeführt wurde, ist es auch interessant, dass NO3− bereits vor der Plasmabestrahlung in nachweisbaren Mengen in den Samen vorhanden war. Diese Methode kann nützlich sein, um die Menge an NO3− zu messen, die ursprünglich in unbehandelten Samen vorhanden war.

EIC von 62 m/z von (a) Blindwert, (b) Standardlösung von NO3− mit einer Konzentration von 1 µM, hochreinem Wasser (c) ohne Plasmabestrahlung und (d) mit Plasmabestrahlung für 5 Minuten und Extrakt von Saat (e) ohne Plasmabestrahlung und (f) mit Plasmabestrahlung für 5 Minuten.

Die Machbarkeit der NO3−-Einführung in Samen durch Luft-SDBD-Plasmabestrahlung bei Atmosphärendruck wurde durch 1D-Simulation unter Verwendung von COMSOL mit 624 Erzeugungs- und Zersetzungsreaktionsgleichungen bewertet, zusammengefasst von Sakiyama et al.39, wobei die Elektronentemperatur Te = 1 eV und die Elektronendichte beträgt Ne = 1013/m3, Gastemperatur Tg = 300 K und Plasmabreite Lp = 0,1 mm für eine Zeitdauer von 1000 s. Die Simulationsergebnisse zeigen die Dichte von NO3− und die der reaktiven Spezies, die an seiner Erzeugung beteiligt sind, an einem Punkt, der 5 mm von der Plasmaregion entfernt ist, die der Keimposition entspricht. Tabelle 1 zeigt die Simulationsergebnisse der Dichte an einem bestimmten Punkt, z. B. Samen, die nach 1000 s unter die SDBD-Elektrode gelegt werden, für NO3− und die reaktiven Spezies, die an seiner Erzeugung durch die folgenden Reaktionen beteiligt sind39,40,41,42:

Die Einheit der Geschwindigkeitskonstante, die den oben genannten Reaktionen entspricht, ist (m3/s). Tabelle 1 zeigt, dass NO3− direkt zu den Samen transportiert wird, zusammen mit dem gleichzeitigen Transport der an seiner Erzeugung beteiligten reaktiven Spezies, wie NO, NO2, NO2−, NO3, HNO3, HNO2 und N2O5. Das DBD-Plasma wird von einer Streamer-Entladung begleitet. Das reduzierte elektrische Feld E/N im anfänglichen DBD-Plasma beträgt ungefähr 100 Td und das im typischen Streamer-Kanal beträgt < 30 Td43. In diesem Zustand beträgt die Elektronentemperatur Te < 2,7 eV und diese Elektronen werden hauptsächlich für die Schwingungsanregung von N2 und O2 in der Luft bei Atmosphärendruck verbraucht. Die Schwingungszustände von N2 und O2 tragen durch die folgenden Reaktionen zur Bildung von NO bei, die allgemein als Zeldovich-Mechanismus bekannt sind44. Die Aktivierungsenergie Ea und die Reaktionsenthalpie ΔH betragen jeweils nahezu 3 eV/mol für R20 und 0,3 eV/mol bzw. − 1 eV/mol für R21.

Daher weist NO in Tabelle 1 die höchste Dichte (6,6 × 1018/m3) auf. NO hoher Dichte kann mit dem H2O in den Samen reagieren. Laut Lukes et al. führt NO durch die folgende Reaktion zu NO3−45.

Die in dieser Studie verwendeten Salatsamen hatten ein durchschnittliches Gewicht ± Standardabweichung von etwa 0,8 ± 0,04 mg/Samen (n = 8). Der Wassergehalt in mehr als 1250 Samen wurde gemessen und betrug 4,705 ± 0,503 Gew.-% (n = 4). Unter Verwendung dieser Mittelwerte wurde die Anzahl der Wassermoleküle im Samen, \({n}_{\mathrm{H}2\mathrm{O}}\), durch Gleichung abgeleitet. (1):

Dabei ist \(w\) das Gewicht von H2O im Samen (37,64 µg/Samen), \({N}_{\mathrm{A}}\) die Avogadro-Konstante (6,022 × 1023/mol) und \ (M\) ist die H2O-Molmasse (18 g/mol). Die Samenfläche betrug 0,393 ± 0,00374 × 10–6 m2 (n = 290), und das Samenvolumen wurde auf 0,393 × 10–9 m3/Samen abgeleitet, unter der Annahme einer Dicke von 1 mm. Das Volumen von NO \(({n}_{\mathrm{NO}})\) und H2O (\({n}_{\mathrm{H}2\mathrm{O}})\) im Samen betrug 2,594 × 109 bzw. 1,259 × 1018. Als NO mit H2O im Samen reagierte, wurden zwei Moleküle NO und ein Molekül H2O verbraucht, um NO2− und NO3− zu erzeugen, wie in R22 gezeigt. Selbst wenn NO vollständig mit H2O reagieren würde, würde daher ausreichend H2O in den Samen verbleiben. In Anbetracht der hohen Dichte von NO in einer stabilen (O2 und H2O)-reichen Umgebung wird der Schluss gezogen, dass der Einführungsweg von NO3− in Samen durch Plasmabestrahlung hauptsächlich die Reaktion (R22) beinhaltet. Andererseits reagiert NO2− laut Sakiyama et al.39 mit NO und erzeugt durch die folgende Reaktion NO− und NO246.

NO− reagiert mit M, O2 und NO und erzeugt NO, O2− und e durch die folgenden Reaktionen47.

NO ist an R22 beteiligt. O2− reagiert mit N2 und O2 und erzeugt e durch die folgenden Reaktionen41.

Das Elektron e reagiert mit NO und O2 und erzeugt NO− und O2− durch die folgenden Reaktionen39,41.

NO− und O2− sind an den Reaktionen von R24-26 bzw. R27, 28 beteiligt.

Die Abbildungen 2 und 4 legen nahe, dass die Plasmabestrahlung keinen Einfluss auf die qualitative Zusammensetzung der Samen hatte. Daher wurden die physikalischen Auswirkungen der Plasmabestrahlung auf die Oberflächenbeschaffenheit der Samenschale mithilfe von Rasterelektronenmikroskopbildern (REM) untersucht. Abbildung 6 zeigt ein typisches REM-Bild, das (a) vor und (b) nach der Plasmabestrahlung erhalten wurde. Die beobachtete Oberfläche war die Seite, auf der das Plasma bestrahlt wurde. Die Samen wurden 10 Minuten lang mit Plasma bestrahlt, was doppelt so lang war wie die Konditionierungszeit der Samen für die Massenspektroskopie. Salatsamen bestehen aus einer äußeren Schicht, dem sogenannten Perikarp, der Samenschale, sowie Hülle, Endosperm und Embryo als innerem Organell48. Bei den in dieser Studie verwendeten Samen wurde ein typisches Perikarp beobachtet, wie in Abb. 6a dargestellt. Das Perikarp blieb nach der Plasmabestrahlung intakt, wie in Abb. 6b dargestellt. Es besteht aus einer komplexen, dynamischen extrazellulären Matrix, die aus einem Netzwerk von Kohlenhydratpolymeren (Cellulose, Hemicellulose und Pektin) und Strukturproteinen besteht48. Die vom Plasma erzeugten chemischen Spezies wie O3 können die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung (C=C) von Alken49, einschließlich der ungesättigten Fettsäuren in den Salatsamen, spalten oder dimerisieren, was zu einem C=C-Verlust führt. Zur Beurteilung einer solchen chemischen Schädigung des Saatguts durch Plasmabestrahlung wurde Raman-Spektroskopie eingesetzt. Ein typisches Raman-Spektrum bei 980–1970 cm−1 von Salatsamen ohne Plasma ist in Abb. S1 dargestellt. Wir können einen Peak bei 1609 cm-1 finden, der dem C=C-Peak entspricht, der Lignin und Flavonoid zugeordnet wird (Abb. S1).

REM-Bild desselben Samens (a) vor der Plasmabestrahlung und (b) nach 10-minütiger Plasmabestrahlung.

Raman-Spektroskopie ergab, dass sich der Lignin und Flavonoid zugeordnete Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungspeak (C=C) nach 5 und 10 Minuten Plasmabestrahlung nicht veränderte (Abb. S2). Die vom Plasma erzeugten chemischen Spezies wie O3 können C=C von Alken49, einschließlich der ungesättigten Fettsäuren in den Salatsamen, spalten oder dimerisieren, was zu einem C=C-Verlust führt, ein solcher Effekt ist jedoch nicht nachweisbar. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Plasmabestrahlung NO3− einbringen kann, ohne die Samen chemisch oder physikalisch zu schädigen.

In dieser Studie haben wir eine Methode zum Nachweis von NO3− entwickelt, das durch Plasmabestrahlung in trockene Salatsamen eingebracht wurde, unter Verwendung von LC-ESI QMS. Bisher wurde nur die Menge an RONS in der Gasphase und Lösung bewertet; Dies ist das erste Mal, dass durch Plasma eingeführte RONS in den behandelten Samen nachgewiesen wurden. Da der molekulare Mechanismus der Zellreaktion des Samens auf exogen eingebrachtes NO3− noch untersucht wird, bleibt NO3− eines der wichtigsten Moleküle im Hinblick auf die Samenphysiologie30. Bisher bestand die einzige Methode zur exogenen Verabreichung von NO3− in Samen darin, diese in eine KNO3-Lösung einzutauchen. Plasma ermöglicht uns jedoch die Einführung von NO3−, ohne dass Wasser oder Gegenionen erforderlich sind. Die quantitative Bewertung der Menge an NO3−, die durch Plasmabestrahlung in Samen eingebracht wird, ist entscheidend für den Beitrag der Plasmawissenschaft zur Pflanzenmolekularbiologie und die quantitative Diskussion des Keimungsinduktionsmechanismus durch Plasmabestrahlung.

Salatsamen (Lactuca sativa L.) wurden von der Asahi Farm, Japan, gekauft. Die experimentelle Verwendung von Pflanzenmaterialien wurde mit Genehmigung der Asahi Farm durchgeführt. Die Samen wurden mit Plasma unter Verwendung einer skalierbaren dielektrischen Entladungselektrode (SDBD)21 bestrahlt. Die Eigenschaften des in dieser Studie verwendeten Plasmas wurden in einem früheren Artikel9 diskutiert. Die Plasmabestrahlung wurde bei 24 °C mit 55 % Rh durchgeführt. Für den NO3−-Nachweis wurden 80 Salatsamen gleichzeitig unter einer einzigen Plasmaexposition bestrahlt. Die Bestrahlungszeit wurde basierend auf den Keimeigenschaften der Samen nach 0, 1, 3 und 5 Minuten Plasmabestrahlung auf 5 Minuten festgelegt. Der Keimungstest wurde mit 30 Samen, die auf einem Papierfilter in einer Petrischale ausgesät wurden, mit 3 ml Leitungswasser in einer Klimakammer bei 22 °C und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden pro Tag durchgeführt. Die Anzahl der gekeimten Samen wurde alle 12 Stunden nach ihrer Aufnahme für 48 Stunden gezählt. Der Prozentsatz der Keimung wurde berechnet, indem die Anzahl der gekeimten Samen durch die Gesamtzahl der Samen in der Petrischale dividiert wurde. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Zwanzig Samen wurden verwendet, um eine Samenextraktprobe nach dem folgenden Verfahren zu erhalten: Die Samen wurden mit Perlen in einem 2,0-ml-Röhrchen (Eppendorf) unter Verwendung einer automatischen Mühle bei 2800 U/min 3 Minuten lang pulverisiert. Die Samenextraktion erfolgte durch 120-minütiges Schütteln der pulverisierten Probe mit 50 µL hochreinem Wasser pro mg Probe bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen. Der Samenextrakt wurde mithilfe eines Membranfilters filtriert, um die Partikel zu entfernen.

Wir verwendeten ESI QMS (G6470A, Agilent) zum Nachweis von NO3− in den Samen mit einer mobilen Phase aus 3,75 mM Ammoniumacetat in 70 % H2O/30 % Acetonitril. Das Profil der mobilen Phase betrug 0,2 ml/min für ESI QMS und 0,4 ml/min für LC-ESI QMS. Das Injektionsvolumen betrug 5 µL. Die Ionisierung wurde im negativen ESI-Modus mit einer Kapillarspannung von 4000 V und einer Turbogastemperatur von 300 °C durchgeführt. und 50 V Splitterspannung. Zur Identifizierung und quantitativen Analyse wurden Agilent Infinity II inklusive LC (G7116A, Agilent) – MWD (G7165A, Agilent) verwendet. Als Säule für die LC wurde Acclaim Trinity (P1, Thermo Fisher) verwendet. Für die Probenverdünnung wurde hochreines Wasser der LC-Qualität verwendet. Das Standardreagenz NO3− wurde von FUJIFILM Wako bezogen.

Das numerische 1D-Modell wurde mit COMSOL Multiphysics 5.4, einer Mehrzweck-Simulationssoftware, entwickelt. Elektronen existieren im Plasmabereich mit einer konstanten Zahlendichte von 1015 m−3, wie in unserer früheren Arbeit35 beschrieben. Wir haben die Partikelverteilung nur in x-Richtung (5 mm) betrachtet, senkrecht zur Oberfläche der Samen. Wir haben Te = 1 eV und Tg = 300 K angenommen. Für die Simulation lagen H2O, O2 und N2 in Bruchteilen von 0,01, 0,21 bzw. 0,78 vor. Wie in einem früheren Artikel erwähnt, wurde für diese Art ein Koeffizientenwert von 10−5 m2/s verwendet39. Die Simulation wurde 1000 s lang durchgeführt, um die Diffusion der reaktiven Spezies zu bestimmen. Alle Reaktionswege und Geschwindigkeitskonstanten wurden der Arbeit von Sakiyama et al.39 entnommen.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder wurden mit Hitachi S-3400 N aufgenommen, der einen Emissionsstrom von 93 μA und eine Beschleunigungsspannung von 15 kV aufweist.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Prof. Takeshi Onodera von der Fakultät für Informationswissenschaft und Elektrotechnik der Universität Kyushu für die Bereitstellung von SEM. Wir danken auch Prof. Nozomi Takeuchi für seine technische Unterstützung und Ermutigung. Diese Arbeit wurde vom QR-Programm (Qdai-jump Research Program) 01255 und der Japan Society of the Promotion of Science (JSPS)-KAKENHI Grant Number JP20H01893, JP19K14700 und JP22K03586 unterstützt. Darüber hinaus wurde es teilweise durch das Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R&D (A-STEP) der Japan Science and Technology Agency (JST) mit der Fördernummer JPMJTR20RU, dem JSPS Core-to-Core-Programm JPJSCCA2019002 und dem JSPS KAKENHI Grant mit der Nummer JP16H03895 unterstützt , JP19H05462, JP21H04451, JP20K14454, Plasma Bio Consortium und Center for Low-Temperature Plasma Sciences, Universität Nagoya.

Fakultät für Informationswissenschaft und Elektrotechnik, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Takamasa Okumura, Kunihiro Kamataki, Naoto Yamashita, Naho Itagaki, Masaharu Shiratani und Kazunori Koga

Zentrum für Plasma-Nano-Interface-Engineering, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Pankaj Attri & Yuichi Tsukada

Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Yushi Ishibashi

Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, Abteilung für Angewandte Biowissenschaften, Tokyo University of Science, Chiba, 278-8510, Japan

Kazuyuki Kuchitsu

Zentrum für neuartige wissenschaftliche Initiativen, National Institutes of Natural Sciences, Tokio, 105-0001, Japan

Kazunori Koga

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TO und K. Koga entwarfen die Studie, bereiteten und charakterisierten die Proben und verfassten das Manuskript. TO führte die Experimente durch. TO, K.Koga, AP und K.Kamataki diskutierten die Simulationen chemischer Reaktionen. TO, K. Koga, YT, YI und K. Kuchitsu diskutierten die biologische Bedeutung der Einführung von Nitrationen. TO, K.Koga, NI, NY und MS diskutierten die chemischen Reaktionen in der Gasphase. TO, K.Koga, AP und MS diskutierten die Organisation des Manuskripts.

Korrespondenz mit Takamasa Okumura.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Okumura, T., Attri, P., Kamataki, K. et al. Nachweis von NO3−, das in plasmabestrahlte trockene Salatsamen eingeführt wurde, mittels Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Quantenmassenspektrometrie (LC-ESI QMS). Sci Rep 12, 12525 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16641-1

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Eingegangen: 26. März 2022

Angenommen: 13. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16641-1

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